细胞蛋白提取方法

1单层贴壁细胞总蛋白的提取1.倒掉培养液，并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液（或将瓶直立放置一会儿使残余培养液流到瓶底然后再用移液器将其吸走）。2.每瓶细胞加3ml4℃预冷的PBS（0.01MpH7.2～7.3）。平放轻轻摇动1min洗涤细胞，然后弃去洗液。重复以上操作两次，共洗细胞三次以洗去培养液。将PBS弃净后把培养瓶置于冰上。3.【配制裂解试剂，现用现配制】按1mlRIPA+25μlPMSF（100mM）+110μlPi（PhosSTOP磷酸酶抑制剂），摇匀置于冰上。（PMSF要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合。）4.每瓶细胞加100μl的裂解液，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧（动作要快），于冰上裂解30min，为使细胞充分裂解培养瓶要经常来回摇动。5.裂解完后，然后用枪将细胞碎片和裂解液移至1.5ml离心管中。（整个操作尽量在冰上进行）6.于4℃下12000rpm离心15min。（提前开离心机预冷）7.将离心后的上清分装转移倒0.6ml的离心管中放于-80℃保存。RIPAPMSFPi(磷酸酶抑制剂)2瓶细胞200μl5μl22μl2（25cm2）4瓶细胞（25cm2）400μl10μl44μl10瓶细胞（25cm2）1ml25μl110μlPhosSTOP磷酸酶抑制剂（stocksolution）配制方法：1片PhosSTOP+1mlRIPA，充分溶解后按110ul封装9管。-20℃保存有效期6月，4℃保存有效期1月。3BCA法测定蛋白浓度检测试剂准备：1．BCA工作液（室温）2．RIPA（1ml）（4℃）3．蛋白工作液（0.5mg/ml）（4℃）4．96-Well板5．冰盒6．待测样品（4℃）操作步骤：1.根据样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B(50:1)配制适量BCA工作液，充分混匀。A:B（50:1）（含8个标准孔）BCA试剂ABCA试剂B5个待测样品3ml60μl10个待测样品4ml80μl15个待测样品5ml100μl20个待测样品6ml120μl42.标准孔加样96-Well12345678RIPA（μl）2019181612840标准品（0.5mg/ml）012481216203.待测样品稀释20倍，19μlRIPA+1μl（待测样品）4.测定本底，20μlRIPA加3孔，取平均值。5.各孔加入200μlBCA工作液，37℃放置20分钟。