DNA的粗提取与鉴定使用

专题5DNA和蛋白质技术课题1DNA的粗提取与鉴定课题目标目标:1本课题通过尝试对植物或动物组织中的DNA进行粗提取，了解DNA的物理化学性质，2理解DNA粗提取以及DNA鉴定的原理。课题重点：DNA的粗提取和鉴定方法。知识要点：1.DNA的物理化学性质，尤其是DNA的溶解性2.二苯胺法鉴定DNA的方法和原理。基础知识1、提取大分子的基本思路是什么？选用一定的物理、化学方法分离具有不同物理或化学性质的大分子。2、提取DNA分子的基本思路又是什么？利用DNA与RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质上的差异，提取DNA，去除其他成分。3、提取和鉴定DNA的具体的依据有哪些方面？(原理)1）、DNA的溶解性①DNA和蛋白质等其它成分在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同。1、在什么浓度下，DNA的溶解度最小？DNA在Nacl溶液中的溶解度是如何变化的？在NaCl溶液浓度低于0.14mol/L时，DNA的溶解度随NaCl溶液浓度的增加而逐渐降低；在0.14mol/L时，DNA溶解度最小；当NaCl溶液浓度继续增加时，DNA的溶解度又逐渐增大。2、如何通过控制NaCl溶液的浓度使DNA在盐溶液中溶解或析出？当氯化钠的物质的量浓度为2mol／L时，DNA的溶解度最大，浓度为0．14mol／L时，DNA的溶解度最低。利用这一原理，可以使DNA在盐溶液中溶解或析出3、提取和鉴定DNA的具体的依据有哪些方面？1）DNA的溶解性①DNA和蛋白质等其它成分在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同。②DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些蛋白质则溶于酒精2）、DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性①蛋白酶只能使蛋白质水解②大多数蛋白质不能忍受60—80℃的高温而变性，但DNA在80℃以上才变性。③洗涤剂能瓦解细胞膜，但对DNA没有影响。3、DNA的鉴定①沸水浴下，DNA遇二苯胺被染成蓝色；二苯胺鉴定DNA的化学原理：DNA中嘌呤核苷酸上的脱氧核糖遇酸生成ω-羟基-γ酮基戊醛，它再和二苯胺作用而呈现蓝色(溶液呈浅蓝色)。鉴定时溶液蓝色的深浅，与溶液中DNA含量的多少有关。②紫外灯照射法：紫外灯照射法用蒸馏水配制质量分数为0.05%的溴化乙锭(EB)溶液，将玻璃棒上缠绕的白色絮状物抹到蜡纸上，再滴1滴EB溶液染色。将蜡纸放在紫外灯(260nm)下照射(暗室中)，可呈现橙红色的萤光(DNA的紫外吸收高峰在260nm处)。③甲基绿（蓝绿色）实验设计（一）实验材料的选取（二）破碎细胞，获取含DNA的滤液（三）去除滤液中的杂质（四）DNA的析出与鉴定实验设计（一）实验材料的选取含有DNA的组织且DNA含量较多的组织。比较下列材料哪些DNA含量高、适于提取DNA？为什么？。较好的实验材料应该满足以下几个条件：1．组织中DNA的含量比较丰富,能够适合大量提取。2．该组织中所含化合物种类应比较单纯,避免由于其他物质化学性质与DNA相近，从而对实验现象产生某些干扰。3．实验材料的价格适宜，从而能相对的降低实验成本。4．实验材料在实验过程中的可操作性较强，在相对简单的条件下能大量提取出DNA，便于学生实验操作（二）破碎细胞，获取含DNA的滤液1、动物细胞：蒸馏水搅拌1、为什么加入蒸馏水能使鸡血细胞破裂？•蒸馏水对于鸡血细胞来说是一种低渗液体，水分可以大量进入血细胞内，使血细胞胀裂，再加上搅拌的机械作用，就加速了鸡血细胞的破裂(细胞膜和核膜的破裂)，从而释放出DNA。旁栏问题（二）破碎细胞，获取含DNA的滤液1、动物细胞：蒸馏水搅拌2、植物细胞：洗涤剂和食盐搅拌和研磨若探究提取效果，可设置对照实验。2、加入洗涤剂和食盐的作用分别是什么？洗涤剂是一些离子去污剂，能溶解细胞膜，有利于DNA的释放；食盐的主要成分是NaCl，有利于DNA的溶解。旁栏问题3．如果研磨不充分，会对实验结果产生怎样的影响？研磨不充分会使细胞核内的DNA释放不完全，提取的DNA量变少，影响实验结果，导致看不到丝状沉淀物、用二苯胺鉴定不显示蓝色等。旁栏问题4．此步骤获得的滤液中可能含有哪些细胞成分？可能含有核蛋白、多糖和RNA等杂质。（三）去除滤液中的杂质方案一：DNA在不同浓度NaCl中溶解度不同；实验设计旁栏问题5．为什么反复地溶解与析出DNA，能够去除杂质？用高盐浓度的溶液溶解DNA，能除去在高盐中不能溶解的杂质；用低盐浓度使DNA析出，能除去溶解在低盐溶液中的杂质。因此，通过反复溶解与析出DNA，就能够除去与DNA溶解度不同的多种杂质。（三）去除滤液中的杂质方案一：DNA在不同浓度NaCl中溶解度不同；方案二：加入嫩肉粉（含木瓜蛋白酶）方案三：60—75℃恒温水浴保温10—15min实验设计旁栏问题6．方案二与方案三的原理有什么不同？方案二是利用蛋白酶分解杂质蛋白，从而使提取的DNA与蛋白质分开；方案三利用的是DNA和蛋白质对高温耐受性的不同，从而使蛋白质变性，与DNA分离。（四）DNA的析出与鉴定：95%的冷酒精静置2—3min，出现白色丝状物玻璃棒卷起加入2mol/L氯化钠溶解，加入4mL二苯胺试剂，摇匀，沸水浴5min，观察颜色变化。（注意设置空白对照）实验设计使用冷的乙醇溶液具哪些优点？一、抑制核酸水解酶活性，防止DNA降解；二、降低分子运动，易于形成沉淀析出；三、低温有利于增加DNA分子柔韧性，减少断裂。P56操作提示•1、血液应加入柠檬酸钠（抗凝剂）防止血液凝固；•2、加洗涤剂，动作要轻缓，防止产生大量气泡；•加酒精、玻棒搅拌，动作要轻缓，以免加剧DNA分子的断裂。•3、二苯胺试剂现配现用。结果分析与评价（一）是否提取出了DNA观察你提取的DNA颜色，如果不是白色丝状物，说明DNA中的杂质较多；二苯胺鉴定出现蓝色说明实验基本成功，如果不呈现蓝色，可能所提取的DNA含量低，或是实验操作中出现错误，需要重新制备。结果分析与评价（二）分析DNA中的杂质本实验提取的DNA粗制品有可能仍然含有核蛋白、多糖等杂质。（三）不同实验方法的比较对于不同的实验方法，本课题可以采用分组的方法进行研究。首先选取不同的实验材料，其次同种材料还可以采用不同方法，从多方面比较实验结果，如DNA的纯度、DNA的颜色、二苯胺显色的深浅等，看看哪种实验材料、哪种提取方法的效果更好。练习提取DNA的第一步是材料的选取，其目的是一定要选取DNA含量较高的生物材料，否则会由于实验过程中或多或少的损失而造成检测的困难；第二步是DNA的释放和溶解，这一步是实验成功与否的关键，要尽可能使细胞内的DNA全部溶解；第三步是DNA的纯化，即根据DNA的溶解特性、对酶及高温的耐受性的不同等特性，最大限度地将DNA与杂质分开；最后一步是对DNA进行鉴定，这是对整个实验的结果的检测。1、请解释提取DNA的实验操作中主要步骤的目的。练习提取蛋白质比提取DNA的难度大。这是因为，与DNA相比，蛋白质对温度、盐浓度、pH等条件要敏感得多，很容易失活；并且蛋白质的空间结构多种多样，理化性质各不相同，使得蛋白质的提取没有一种统一的方法，只能根据特定蛋白质的特性摸索提取的条件，设计特定的方法。2、你认为从细胞中提取某种特定的蛋白质与提取DNA一样容易吗？为什么？案例一：以鸡血为实验材料进行DNA的粗提取实验案例②鸡血细胞极易吸水胀破，而用动物肝脏细胞作实验材料常常需要匀浆和离心，对设备要求较高，操作繁琐，历时较长1、鸡血细胞做实验材料的原因①鸡血细胞核的DNA含量丰富，材料易得2、实验原理①DNA在NaCl溶液中的溶解度，是随着NaCl的浓度的变化而改变的。当NaCl的物质的量浓度为0.14mol／L时,DNA的溶解度最低。利用这一原理，可以使溶解在NaCl溶液中的DNA析出。②DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些蛋白质可以溶于酒精溶液。利用这一原理，可以进一步提取出含杂质较少的DNA。③DNA遇二苯胺（沸水浴）会染成蓝色，因此，二苯胺可以作为鉴定DNA的试剂。4、课前准备鸡血细胞液取质量浓度为0．1g/ml的柠檬酸纳溶液（抗凝剂）100ml，置于500ml烧杯中。注入新鲜的鸡血（约180ml），同时用玻璃棒搅拌，使血液与柠檬酸纳溶液充分混合，以免凝血。将烧杯中的血液置于冰箱内，精置一天，使血细胞自行沉淀。（也可以将血液倒入离心管内，用1000r/min（转每分）的离心机离心2min，血细胞沉淀于离心管底部。实验时。用吸管除去离心管上部的澄清液，就可以得到鸡血细胞液。）①过程②柠檬酸钠作用防止血液凝固③作用机理柠檬酸钠能与血浆中的Ca2+发生反应，生成柠檬酸钙络合物，血浆中游离的Ca2+大大减少，血液就不会凝固鸡血细胞破碎以后释放出的DNA，容易被玻璃容器吸附，所以在提取过程中为了减少DNA的损失，最好使用塑料的烧杯和试管盛放鸡血细胞液④注意事项讨论：提取鸡血中的DNA时，为什么除去血液中的上清液？答：血液分为两部分，一部分是血浆，一部分是血细胞，离心后除去的上清液是血浆5、方法步骤将制备好的鸡血细胞液5mL～10mL，注入到50mL烧杯中。向烧杯中加入蒸馏水20mL，同时用玻璃棒充分搅拌5min，使血细胞加速破裂。然后，用放有纱布的漏斗将血细胞液过滤至500mL。取其滤液。①提取鸡血细胞的细胞核物质讨论：答：让细胞内浓度大于周围溶液的浓度，细胞会吸水以至胀破（1）为什么要加入蒸馏水？加入蒸馏水后细胞会有什么变化？（2）用玻璃棒搅拌有什么意义？答：用玻璃棒搅拌可以加速血细胞和细胞核的破裂。注意应沿一个方向快速搅拌，但也不能太快太猛，防止打碎DNA（3）滤去的是什么物质？得到的是什么？答：过滤将滤去的是细胞膜和核膜等物质；得到的是与蛋白质等物质结合在一起的DNA②溶解细胞核内的DNA将氯化钠的物质的量浓度为2mol的溶40mL加入到滤液中，并用玻璃棒沿一个方向搅拌1min，使其混合均匀，这时DNA在溶液中呈溶解状态沿烧杯内壁缓缓加入蒸馏水，同时用玻璃棒不停地轻轻搅拌，这时烧杯中有丝状物出现，注意观察丝状物呈什么颜色。继续加入蒸馏水，溶液中出现的粘稠物会越来越多。当粘稠物不再增加时停止加入蒸馏水（这时溶液中氯化钠的物质的量浓度相当于0.14mol／L）③析出含DNA的粘稠物讨论：加入蒸馏水的目的？降低NaCl溶液浓度到使DNA溶解度最低点，使DNA从NaCl溶液中析出将溶液中的DNA与其他杂质分离，这一步骤是实验成败的关键。实验中应该缓慢贴壁加入蒸馏水，并轻轻地沿一个方向不停地均匀搅拌，以利于DNA分子的附着和缠绕注意事项：④滤取含DNA的粘稠物用放有多层纱布的漏斗，过滤步骤3中的溶液至500mL的烧杯中，含DNA的粘稠物被留在纱布上⑤将DNA的粘稠物再溶解取1个50mL烧杯，向烧杯内注入氯化钠的物质的量浓度为2mol／L的溶液20mL。用钝头镊子将纱布上的粘稠物夹至氯化钠溶液中，用玻璃择不停地搅拌，使粘稠物尽可能多地溶解于溶液中⑥过滤含有DNA的氯化钠溶液取1个100mL烧杯，用放有两层纱布的漏斗过滤步骤5中的溶液。取其滤液，DNA溶于滤液中⑦提取含杂质较少的DNA在上述滤过的溶液中，加入冷却的、酒精的体积分数为95％的溶液50mL（使用冷却的酒精，对DNA的凝集效果较佳），并用玻璃棒搅拌，溶液中会出现含杂质较少的丝状物。用玻璃棒将丝状物卷起，并用滤纸吸取上面的水分。这种丝状物的主要成分就是DNA答：因为DNA不溶于冷酒精，而其他物质可以溶解在酒精中，使含杂质较少的DNA丝状物可以析出,悬浮于溶液中讨论：（2）观察丝状物呈什么颜色？答：白色（1）为什么要加50mL的冷酒精？取两支20mL的试管，各加入氯化钠的物质的量浓度为0．015mol／L的溶液5mL，将丝状物放入其中一支试管中，用玻璃棒搅拌，使丝状物溶解。然后，向两支试管中各加入4mlL的二苯胺试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min，待试管冷却后，观察并且比较两支试管中溶液颜色的变化⑧DNA的鉴定讨论：答：有丝状物的试管变成蓝色，另一试管还是原来颜色（2）这一鉴定结果说明什么问题？（1）比较两个试管中溶液的颜色有什么不同？答：提取出的丝状物是DNA（3）DNA的直径约为20×10-10m，