Western-Blot基本原理及操作

WesternBlot基本原理及操作中山医院临床医学研究院侯嘉云[e-mail],cancerresearch,2011流程蛋白提取蛋白提取蛋白提取蛋白提取蛋白提取蛋白提取蛋白提取蛋白提取蛋白定量蛋白定量•简介以医院logo颜色为整体色系，总体以简洁、突出ppt展现内容为主。•简介以医院logo颜色为整体色系，总体以简洁、突出ppt展现内容为主。样品准备样品制备过程中的一些要点与建议•收集细胞离心时转速需适当；•尽量去除核酸，多糖，脂类等干扰分子；•防止蛋白质在样品处理过程中的人为的对蛋白修饰的改变，制备过程应在低温进行；•样品建议分装成合适的量，然后冷冻干燥或直接以液体状态置-80℃中保存，但要注意不要反复冻；•煮样时防止爆管分离胶凝胶浓度与蛋白分离范围凝胶制备-分离胶灌制分离胶隔绝空气ddH2O0.1%SDS:8%异丁醇：8%浓缩胶(5%)凝胶制备-积层胶灌制积层胶插入梳子制备凝胶中的要点•AP要新鲜配制；•混合搅拌速度太快易产生气泡影响聚合，导致电泳带畸形，太慢不均匀；•分离胶勿倒的过满，需留一定的空间；•凝胶需缓慢凝固，TEMED、AP用量过多会导致胶太硬，从而电泳时易烧胶•保持所有装置清洁；•试剂要有正确的pH值，及妥当的保存凝胶电泳StakinggelSeparatinggel小的电压会使胶的分子筛效应得到充分发挥；浓缩胶80v左右，分离胶100v左右上样的注意要：•20--50ug总蛋白或100ng纯蛋白，可根据蛋白表达水平进行优化；•尽量保持每个泳道的蛋白量一样，体积尽量一致；•样品两侧的及空置的泳道用等体积的1×loadingbuffer上样以医院logo颜色为整体色系，总体以简洁、突出ppt展现内容为主。转膜转膜转膜转膜转膜转膜中的要点与建议封闭抗体孵育抗体孵育直接法与间接法的比较直接法间接法快速（一种抗体）额外的二抗孵育以及条件优化没有二抗交叉反应引起的非特异性条带交叉反应引起的非特异性条带无信号二级放大信号放大灵敏度高（多个二抗结合位点）免疫反应性降低免疫特异性不受标记影响对照内参的选择•目的蛋白分子量相差5KD以上•实际的试验环境组织缺氧、糖尿病：GAPDH升高凋亡及移除核膜：Lamin骨骼肌：beta-actin检测方法常见问题-信号弱或无信号常见问题-高背景常见问题-条带位置不对或有非特性条带常见问题-块状染色常见问题-弥散常见问题-条带弯曲常见问题-其他安全注意事项原则操作有毒试剂，带口罩和手套操作挥发性试剂应在通风橱中进行安全注意事项•PMSF：苯甲基磺酰氟是一种高强度毒性的胆碱酯酶抑制剂，它对呼吸道黏膜、眼睛和皮肤有非常大的破坏性，可因吸入、咽下或皮肤吸收而致命•TritonX-100：引起严重的眼睛刺激和灼伤，可因吸入、咽下或皮肤吸收而受害•SDS(十二烷基硫酸钠)：有毒，是一种刺激物，并造成对眼睛的严重损伤的危险•DTT（二硫苏糖醇）：很强的还原剂，散发难闻的气味，可因吸入、咽下或皮肤吸收而危害健康，由于容易被空气氧化，因此DTT的稳定性较差•Acr（丙烯酰胺）：具有很强的神经毒性，同时还有生殖、发育毒性，可能具有致癌性，可通过皮肤吸收及呼吸道进入人体，其作用具有积累性。聚丙烯酰胺无毒，但也应谨慎操作，因为有可能含有少量的未聚合成分•Bis（甲叉双丙烯酰胺）：有毒，影响中枢神经系统，切勿吸入粉末•AP(过硫酸铵)：对黏膜和上呼吸道组织、眼睛和皮肤有极大危害性。吸入可致命•TEMED：强神经毒性，防止误吸，操作时快速，存放时密封•NaN3(叠氮钠)：毒性非常大，阻断细胞色素电子运送系统谢谢！