荧光定量PCR：数据处理、实验要素、结果评价

荧光PCR的数据处理2主要应用●实时检测–绝对定量–相对定量●终点法检测–等位基因鉴别（SNP检测）–阴阳性检测3定量PCR－QuantitativePCR●Howmany?–绝对定量AbsoluteQuantitation●Howmuch?–相对定量RelativeQuantitation4ResultsfromRNasePInstrumentVerificationPlate●Standardcurveamplificationsshowing20K,10K,5K,2.5Kand1.25Kcopypopulationsinreplicatesoffour●“Unknown”amplificationsshowing10Kand5Kcopypopulationsinreplicatesof365ResultsfromRNasePInstrumentVerificationPlate6CalculatingDNAQuantityofaSampley=-1.2908Ln(x)+27.187R2=0.9972022242628303234360.0010.0100.1001.00010.000100.000CT(LogN)initialconcentrationSample7DataReportTable8相对定量●Relativegeneexpression:–Comparetreatedsamplesvs.untreatedsamples(calibratorsamples)–RNAivalidation–Arrayvalidation9相对定量●ΔΔCt–相对量＝2-ΔΔCt–目标序列和内参序列的扩增效率相等（且接近100％）●TheRelativeStandardCurveMethodEndo——EndogenousControl10RelativeExpression11等位基因分析AllelicDiscrimination(SNPDetection)12等位基因鉴定机理野生型(wt)突变型(mut)13FAMVICHomozygoteforFAM-specificalleleFAMVICHomozygoteforVIC-specificalleleFAMVICHeterozygoteforbothallelesAllelicDiscriminationAssay14AllelicDiscriminationDyeComponentsViewerFAMVIC15阴阳性鉴定－Plus/MinusAssayPathogenInternalPositiveControl+-=Yes=No-+=Yes++=NoAmp--16Targetvs.IPCCompetitionTargetIPC定量PCR的实验要素18定量PCR实验要素●目标基因样品●标准曲线标准品●监控系统故障阳性对照●监控污染阴性对照●校准生物学误差内参照(EndogenousControl)●校准物理误差参比荧光(ROX)●降低其余误差重复实验19样品（参考指标）●DNA纯度：OD260/OD280=1.8，1.6~2.0之间●DNA用量：0.05ng–100ng●RNA纯度：OD260/OD280=2.0●cDNA用量：1-100ng总RNA反转录的cDNA取1uLNanoDrop(1-2µlofundilutedsample)20阳性对照PositiveControls●检测效果验证●形成检测效果的参数：–线性范围–灵敏度–扩增效率●来源–PCR产物–质粒–阳性样本21阳性对照－标准品●目的：–了解检验系统性能；–生成标准曲线；●要求：–仪器、试剂、循环参数相同；–与样品的扩增效率一致。CT=-klgX0+b22标准品梯度稀释方法●选择目标→提取/PCR→纯化→测定浓度→调整浓度→梯度稀释●CT值在18-30之间，覆盖全部样品浓度区间●10倍连续梯度稀释方法：–1倍体积原液(标准品i)+9倍体积稀释缓冲液→标准品ii–1倍体积标准品ii+9倍体积稀释缓冲液→标准品iii–1倍体积标准品iii+9倍体积稀释缓冲液→标准品iv–…………不可分别加不同体积的稀释缓冲液直接得到标准品梯度23标准品的注意事项●根据目的和条件选择标准品单位；●考虑可能的影响因素－提取：–如转基因，标准品是将转基因与非转基因食品粉末按重量比混合，然后抽提混合DNA；–/先抽好转基因DNA，再梯度稀释0–/分别抽提转基因与非转基因DNA按比例混合024n=301+Ex=1.95N=N01.9530=N0x5.0x108n=301+Ex=1.90N=N01.9030=N0x2.3x108相差2.2倍（Ex=扩增效率；n=循环圈数；No=起始模板分子数；N=扩增产物分子数）PCR效率对定量结果的影响25K=-1/log(1+Ex)PCR效率测定26阴性对照●实验效果验证●评价特异性：–电泳–融解曲线–测序●来源：–NoTemplateControl–NoRTControl27双重和多重定量？●在使用TaqManMGB探针的情况下，你认为管家基因与目标基因是在同一管内做多重定量好，还是分成两管分别定量好？哪一种检测的数据更精确？28ROX校准增加数据精度29复管测试●样品和标准品都要重复●重复次数须遵循统计学要求30误差的校正●生物学方面的误差：EndogenousControl校正–细胞数量的差异、抽提效率、纯化损失、反转录效率等●物理方面的误差：ROX校正–枪的误差（如试剂体积）、耗材质量（如管盖厚度、透光性能不一致）所导致的光能损失、仪器稳定性（如孔间、批间温度的波动）的误差等●其余的误差：统计校正–重复实验，取平均值荧光定量PCR结果评价标准32Real-TimePCR结果评价标准●线性范围DynamicRange:5logs●相关性:R2Value0.99●灵敏度Sensitivity:●精密度Precision:standarddeviation33线性范围DynamicRange●高浓度Ct值提前并不等同于扩增效率高；●较小实验线性范围可能导致更大的斜率（扩增效率）偏差。34相关性●R2Value35灵敏度Sensitivity：低拷贝的检测●Poissondistribution36精密度Precision●正态分布●2倍差异的样本–99.7%置信度：σ1/6=0.167–95%置信度：σ1/4=0.2537统计分析增加低浓度样本的重复数灵敏度标准差0.167至少3个重复精密度R20.99Slope～-3.35个数量级梯度稀释效率指标建议因素评价荧光PCR结果的（推荐）标准38影响Ct值的因素●模板浓度●扩增体系–PCR效率–灵敏度除此之外影响Ct值的因素还有哪些？39影响Ct值的因素●影响荧光检测的因素:–试剂–仪器●不同试剂、不同反应条件、不同分析参数得到的Ct值不能直接比较。40荧光值算法Rn=-------------------------------ΔRn=Rn-baselineFluorescenceofReporterdyeFluorescenceofPassiveReference41影响Ct值的因素：荧光值影响Ct值●影响荧光值的因素：–温度–pH–试剂：盐浓度……●相同浓度的荧光基团、ROX在不同MasterMix中有不同的荧光强度：42影响Ct值的因素：荧光值影响Ct值●不同的MasterMix扩增相同浓度模板，Ct值不同：43ROX浓度的影响●降低ROX浓度使Ct值提前，但导致Ct值标准偏差扩大。44总结●评价PCR反应的性能，需全面分析稀释梯度线性范围、结果稳定性、荧光信号、背景、扩增效率、R2、精密度、灵敏度等等指标；●经过验证的对照品(notemplatecontrol,noRTcontrol)和模板数量。45Q&A谢谢！