转录组分析(RNA-Seq)

转录组分析（RNA-Seq）•李江攀RNA-Seq的技术背景RNA-Seq的应用领域RNA-Seq面临的挑战及发展前景RNA-Seq的技术背景RNA-Seq又称转录组高通量测序（transcriptomesequencing）或称为全转录组鸟枪法测序（WholeTranscriptomShotgunSequencingWTSS）原则上,所有的高通量测序技术都能进行RNA测序。自2005年以来,以Roche公司的454技术、Illumina公司的Solexa技术和ABI公司的SOLiD技术为标志的新一代测序技术相继诞生,之后HelicosBiosciences公司又推出单分子测序(Singlemoleculesequencing,SMS)技术。新一代测序又称作深度测序或高通量测序,是相对于传统的Sanger测序而言,主要特点是测序通量高,测序时间和成本显著下降。各平台测序原理及序列长度的差异决定了各种高通量测序仪具有不同的应用侧重转录组是特定组织或细胞在某一发育阶段或功能状态下转录出来的所有RNA的集合转录组？RNA-Seq原理把高通量测序技术应用到由mRNA逆转录生成的cDNA上,从而获得来自不同基因的mRNA片段在特定样本中的含量,这就是mRNA测序或mRNA-Seq,同样原理,各种类型的转录本都可以用深度测序技术进行高通量检测,统称作RNA-Seq-6-TotalRNARichmRNA(polyARNA)Fragmentation(200~700bp)Oligo(dT)primedcDNAsynthesisPaired-endSolexaSequencingRandomhexamerprimedcDNAsynthesisRNAfragment(200~700nt)RandomhexamerprimedcDNAsynthesisProcedureofRNA-Seq1.样品RNA准备2.测序文库构建􀂾使用oligodT微珠纯化mRNA􀂾mRNA片段化处理􀂾反转录反应合成合成双链cDNA􀂾双链DNA末端修复及3’末端加‘A’􀂾使用特定的测序接头连接DNA片段两端􀂾高保真聚合酶扩增构建成功的测序文库3.DNA成簇（Cluster）扩增4.高通量测序（IlluminaGenomeAnalyzerIIx）5.数据分析􀂾原始数据读取􀂾与数据库比对并进行注释􀂾深层次数据分析RNA-Seq的应用领域图所示RNA-seq获得的数据能够进行全面的数据挖掘，既能够进行基因结构分析，鉴定UTR、可变剪切位点，也能够发现新的转录本及非编码RNA，比较样本间的表达水平差异RNA-Seq面临的挑战庞大的数据量所带来的信息学难题如何针对更复杂的转录组来识别和追踪所有基因中罕见RNA亚型的表达变化目前的高通量测序技术大都需要较多的样品起始量,这使得来源极为有限的生物样品分析受到限制,因此如何对单细胞或少量细胞进行转录组测序是一个亟待解决的问题RNA-seq常见问题•送样要求：浓度≥400ng/ul，RNA总量≥20ug；OD260/280为1.8-2.2，28S/18S＞1.8，RIN≥8.•在进行原核生物转录组分析时需要提供纯化后的原核生物mRNA或cDNA样品。•进行非编码RNA测序时需要提供去除rRNA和tRNA的RNA样品。•测序1Gb的转录组数据时通常可以得到长度大于500bp的Unigene12000个以上，但转录组大小受基因数目和基因丰度双重影响，组织差异、状态和实验处理也会影响转录组组成。RNA-Seq的发展前景1、虽然RNA-Seq技术还面临着种种困难,但作为一个刚刚起步的新技术RNA-Seq已经显示出其他转录组学技术无可比拟的优势：既能提供单碱基分辨率的转录组注释又能提供全基因组范围的“数字化”的基因表达谱,而且其成本通常比芯片和大规模的SangerEST测序要低,有2、就目前来看,作为两个高通量的转录组学研究技术,在应用的某些方面既存在重叠和竞争也存在优势互补,一种技术能弥补另一种技术遗漏的部分,通常对一个生物学问题的回答需要不同实验技术的协同配合3、RNA-Seq的强项,就在于它是一个“开放系统”,它的发现能力和寻找新的信息的能力从本质上高于芯片技术,相信随着相关学科的进一步发展和测序成本的进一步降低,RNA-Seq必将在转录组学研究领域占主导地位特点数字表达谱芯片数字化信号√高通量√√可重复性高√无需重复实验√检测低丰度基因√检测新转录本√检测反义链转录本√数字表达谱与芯片的比较