三维细胞培养技术培训

主讲人：赛哲生物曾宏彬水凝胶三维细胞培养广州赛哲生物科技有限公司服务热线：400-888-4242①什么是三维细胞培养②如何实现三维细胞培养③水凝胶三维细胞培养④更多问题2341广州赛哲生物科技有限公司服务热线：400-888-4242什么是三维细胞培养建立体外三维培养模型将有助于跨越二维细胞培养与动物实验之间的鸿沟。通过模仿体内环境的特性，并利用传统的细胞培养研究工具，三维细胞模型提供了独特的视角来观察干细胞的行为、组织器官和肿瘤的发展过程。这些研究模型有利于加速癌症生物学和组织工程领域的转化研究。——KennethM.Yamada,andEdnaCukierman.ModelingTissueMorphogenesisandCancerin3D.[J]cell.130,601-610.11什么是三维细胞培养3D2DVS2如何实现三维细胞培养水凝胶固体支架磁力悬浮2如何实现三维细胞培养固体支架三维培养：组织工程支架作为组织工程的平台，不仅提供了细胞生长的框架，使之形成特定的组织或器官形状；而且作为细胞外基质成分之一，是细胞间信号传导和相互作用的媒介，同时也是细胞生长所必需的生物活性剂。目前用于组织工程支架的人工合成可降解聚合物主要包括脂肪族聚酯、聚偶磷氮、聚酸酐等。其中研究最多的是脂肪族聚酯，特别是聚乳酸（PLA）、聚乙醇酸（PGA）及其共聚物等。2如何实现三维细胞培养磁力悬浮三维培养：美国莱斯大学和德克萨斯大学M.D.Anderson癌症中心的研究人员开发出一种生物装配器（bioassembler）。这个系统使用磁力让细胞悬浮，并促使细胞生长成三维的形状。尤其适于培养肝脏和心脏这种细胞密度比较大的实体器官。文章发表在2013年3月14日的《NatureNanotechnology》上2如何实现三维细胞培养将细胞培植在一定的细胞外基质中,细胞外基质（extracellularmatrix,ECM）蛋白充当生长支架。水凝胶三维培养：3水凝胶三维细胞培养MatrigelCollagenIAgarose3水凝胶三维细胞培养从富含胞外基质蛋白的EHS小鼠肿瘤中分离出BDMatrigel基底膜基质，其主要成分由层粘连蛋白，Ⅳ型胶原，巢蛋白，硫酸肝素糖蛋白等组成，还包含生长因子和基质金属蛋白酶等。Matrigel在室温条件下，聚合形成具有生物学活性的三维基质，模拟体内细胞基底膜的结构、组成、物理特性和功能，有利于体外细胞的培养和分化，以及对细胞形态、生化功能、迁移、侵染和基因表达的研究。可促进上皮细胞、肝细胞、Sertoli细胞、黑色素瘤细胞、血管内皮细胞、甲状腺细胞及毛囊细胞等的贴壁与分化。同时，Matrigel还能影响乳腺上皮细胞的蛋白表达，支持外周神经的新生和牛输卵管上皮细胞的分化。高浓度的Matrigel适用于研究体内血管生成和肿瘤细胞迁移及肿瘤模型的建立等。3水凝胶三维细胞培养I型胶原在大部分组织中都有分布，尤其在骨组织、肌腱以及真皮组织中含量极其丰富。I型胶原一般是分离自大鼠尾中，也常被称为鼠尾胶。Agarose在酸性条件下成液态，一般保存于醋酸溶液中。使用时，需用PBS稀释成合适的浓度（大于1mg/ml），并用氢氧化钠调节PH值至7.2-7.4，可聚合形成具有生物学活性的三维基质。一般用于软骨细胞、骨细胞的三维培养，血管形成试验等。3水凝胶三维细胞培养美国布朗大学的生物工程师JeffreyMorgan利用琼脂糖开发出一种细胞三维培养皿。CollagenI将融化的琼脂糖制成微型培养板（micro-moulds），等琼脂糖凝固之后，再将这种琼脂糖材料放置到普通的培养板里。再在培养板里加入细胞和培养基，由于重力的作用，细胞会沉积到琼脂糖培养板里，彼此聚集在一起，形成球形的多细胞团块。3水凝胶三维细胞培养试剂盒组分①BDMatrigel②PBS缓冲液③细胞回收液赛哲生物®水凝胶三维细胞培养系列试剂盒（#SZCE13001~#SZCE13010）乳腺癌系列、胃癌系列、宫颈癌系列、肝癌系列、肺癌系列分别用于胶上培养、胶内培养3水凝胶三维细胞培养胶内培养胶上培养铺胶接种细胞培养收集细胞Or观察与检测3水凝胶三维细胞培养铺胶胶上培养：薄胶（30~50μL/cm2），形成约0.5mm厚度的凝胶胶内培养：薄胶（可选）+厚胶（100~200μL/cm2），形成大于1mm厚度的厚胶操作步骤：铺胶前的准备：Matrigel置于冰上融解；使用到的所有器材（吸头、小管、培养板）须冰预冷。铺胶：薄胶：用冰预冷的吸头吸取60~100μL液态的Matrigel，均匀涂抹孔板底部，使其厚度均匀，避免产生气泡；在37℃放置30分钟，即可成胶。3水凝胶三维细胞培养接种和培养胶上培养：制备细胞悬液，以合适的密度接种于薄胶上，即可进行培养；胶内培养：制备细胞悬液，调整至合适的细胞密度，取100~200μL与Matrigel等比例混合均匀，接种于孔板中，在37℃放置30分钟，成胶后，在胶面上轻轻加入完全培养基即可进行培养。TIPS：一般用于肿瘤微球形成、侵袭等观察，接种密度应控制在2000-3000cells/孔；观察血管形成接种密度需达到105cells/孔。3水凝胶三维细胞培养细胞处理药物刺激：胶上层培养液中加入刺激药物细胞转染：胶上培养：①使用sagene3D-HG（#SC1201）三维培养专用转染试剂②使用慢病毒or腺病毒感染胶内培养：使用慢病毒or腺病毒感染3水凝胶三维细胞培养细胞的回收细胞回收液（cellrecoverysolution）：不含酶，能够解聚matrigel1-2ml细胞回收液，轻轻刮起含有细胞的凝胶（禁止吹吸），转入2ml离心管中，置于冰上融解约30min，每隔5-10min来回颠倒一次，待观察到细胞团可顺利沉至管底部，4℃，3000rpm离心5min，收集细胞。优点：细胞可保持在胶内的形态，不含酶，对细胞伤害小。缺点：凝胶去除不彻底，有可能影响到后续检测。3水凝胶三维细胞培养细胞的回收酶消化：胰酶（0.25%）1-2ml酶液，置于37℃消化15-30min，待观察到细胞团逐渐散开，3000rpm离心5min，收集细胞。优点：凝胶去除较彻底缺点：对细胞伤害较大，继续培养效果差分散酶（dispase）1-2ml酶液，置于37℃消化2hours，待观察到细胞团逐渐散开，3000rpm离心5min，收集细胞。优点：凝胶去除较彻底，对细胞伤害小，可继续培养缺点：耗时长、价格高3水凝胶三维细胞培养观察与检测形态观察：乳腺上皮细胞MCF-10A细胞形成的乳腺腺泡结构前列腺癌细胞PC3的侵袭性观察3水凝胶三维细胞培养观察与检测实时荧光定量PCR检测mRNA、miRNA抽提RNA：不需要除去凝胶，可直接加入trizolorbioopure，抽提RNA；样品编号260/280Conc.(ng/ul)12.07206822.041802.232.111660.842.061267.412341：不去胶2：不去胶3：去胶4：去胶AmplificationplotofActin3水凝胶三维细胞培养观察与检测不去胶去胶GAPDHWesternblot检测蛋白若检测大分子蛋白，一定要除去凝胶，回收细胞后提取蛋白细胞回收液或酶消化均可3水凝胶三维细胞培养观察与检测细胞增殖检测（MTT法）不需要除去凝胶，可直接加入MTT孵育一定要设不含细胞，只含有凝胶的空白对照孔3水凝胶三维细胞培养观察与检测免疫荧光观察蛋白定位胶上培养：可直接固定、孵育抗体等操作胶内培养：需回收细胞采用细胞回收液回收细胞，维持细胞团结构，重新接种于圆形盖玻片上，使细胞贴附于玻片上，再进行固定、抗体孵育等步骤TIPS：抗体孵育或染色后，洗涤次数需增加，时间最好延长至15min若需进行激光共聚焦观察，可直接在厚度为0.13-0.17mm圆形盖玻片上铺胶接种细胞3水凝胶三维细胞培养观察与检测免疫荧光观察蛋白定位不去胶去胶DAPIβ-tublinoverlay3水凝胶三维细胞培养观察与检测免疫荧光观察蛋白定位S1cellT4-2cellCARE-CadherinConfocalFluorescenceMicroscopy3水凝胶三维细胞培养试剂盒组分①Salmonfibringen②Salmonthromin③PBS缓冲液④酶消化液赛哲乳腺癌肿瘤干细胞筛选试剂盒——专利产品采用Salmonfibringen在Salmonthromin的作用下，形成血纤蛋白凝胶。通过调节纤维蛋白原的浓度使形成的水凝胶的硬度在80～100pa范围内，使乳腺癌干细胞能够在基质中增殖，并维持其自我更新的特性，从而筛选获得肿瘤干细胞微球。3水凝胶三维细胞培养CD24ACCD44CD24GAPDH筛选后筛选前CD44BD3水凝胶三维细胞培养案例分析内容内容AnyQuestion?4更多问题