植物转录组国内外研究进展

植物转录组国内外研究进展摘要：植物转录组学是一门新兴学科，通过提取植物中mRNA进行逆转录，随后建立cDNA文库并利用近几年兴起的RNA-seq高通量测序技术进行分析，以揭示植物细胞内整体水平的基因表达状态和基因结构信息，从而深刻理解植物组织基因型和表型之间的相互关系，以及在分子水平上弄清楚基因和功能表达之间的联系，对研究生物体作用机理的分子机制具有重要意义。本文主要介绍了植物转录组测序的技术发展历史、测序平台比较、转录组测序技术的优势以及在植物上的应用。随着高通量测序技术和生物信息学分析工具的迅猛发展，植物转录组学将面临巨大挑战和更广阔的应用前景。关键词：植物转录组学，RNA-seq，高通量测序技术，基因表达状态，基因结构信息TheProgressonPlantTranscriptomeResearchinChinaandAbroadAbstract:Asanewsubject,planttranscriptomeaimsatthegeneexpressionstatusandgenestructureinformationwithintheplantcell.ItneedsextractingmRNAinplantsforreversetranscriptionandestablishingcDNAlibrarytoanalyzeHighthroughputsequencetechnologyresults,whichrisesinrecentyears.Thus,wecouldhaveadeepunderstandingoftherelationshipbetweengenotypeandphenotypeinplanttissues,andtheclearlinksbetweengenesandtheirfunctionalexpressionsatthemolecularlevel.Itisofgreatsignificancetostudymolecularmechanismoftheactionsoforganisms.Inthisstudy,weillustratethedevelopmentofthetechnologyofplanttranscriptomesequencing,thecomparisonofthesequencingplatform,theadvantagesofthesequencingtechnologyandtheapplicationinplant.Withtherapiddevelopmentofhighthroughputsequencingtechnologyandbioinformaticsanalysestools,planttranscriptomeresearcheswillfacegreatchallengesandwideapplicationprospect.Keywords:planttranscription,RNA-seq,highthroughputsequencingtechnology,geneexpressionstatus,genestructureinformation基因组(Genome)，作为生物遗传物质的基础，由成千上万的碱基组合而成，其含有生物的所有遗传信息,通过测序可以获得这些基因组的遗传信息。虽然基因的表达由于受到某些激发子的诱导则不尽相同，但是近年来,高通量测序技术的飞速发展,使得对基因表达的研究变得容易,对两个不同样品差异表达基因的研究也得以开展。转录组(Transcription)这一概念由VelculescuVE.等[1]首先提出，它是特定细胞或组织在特定发育阶段或生理状态下转录出来的所有RNA的集合。植物细胞具备特定的空间性和时间性[2]，即同一细胞在不同的生长阶段及生长环境下，基因的表达情况是存在差异的，故转录组可对植物不同组织或不同生理状态下差异表达基因进行研究和探讨,进而发掘与特定生理功能相关的基因、转录本SNP以及各种分子标记等基因资源,将利于研究人员对非模式生物的遗传信息有全面深刻的了解。转录组学是一门在整体水平研究转录组，即某一阶段特定组织或细胞中全部转录本的种类、结构、功能以及转录调控规律的科学[3]，能够通过研究大规模基因表达的分析来揭示参与特定生命过程的基因及这些基因的状态变化，即从RNA水平上研究基因表达情况。对同一样品进行转录组测序可获得低表达量基因，而对不同样品进行同时测序可以获得样品之间的差异表达基因。对有参考基因组的转录组进行研究可以获得转录本的表达丰度、差异表达基因、转录发生位点、可变剪切位点及转录本SNP等重要生物学信息[4]。而对于没有参考基因组的物种，可以对转录组测序reads片段进行denovo（重新）组装，从而获得该物种的单拷贝基因序列集(unigenes)，对于研究物种的基因组和功能基因信息具有重要意义。１.转录组的高通量测序技术高通量测序技术是转录组学的主要研究方法。目前,用于转录组学研究的高通量测序技术主要有表达序列标签(expressedsequencetags,ESTs)、基因表达系列分析技术(Serialanalysisofgeneexpression;SAGE)、大规模平行测序技术(MassivelyparallelsignaturesequencingMPSS)、基因芯片(Microassay)及第二代高通量测序技术(RNA-Seq)。由于RNA-Seq测序技术能够较为快速、准确地为人们提供更多的生物体转录信息，故RNA-seq成为最新兴起的利用深度测序进行转录组分析的技术，受到广泛关注。它们的技术流程[5]如图1-2所示。基因芯片cDNA转录组RNA杂交SAGEcDNA片段带接头的cDNA片段RNAcDNA双标签标签多连体测序锚定酶连接、PCR标签酶锚定酶连接接头连接接头T4聚合酶杂交、测序dGTPMPSSRNAcDNA带接头的cDNA文库转录组单链cDNA文库RNA-seqcDNARNAcDNA片段cDNA文库PCR转录组测序图1-1不同高通量测序平台比较[25,26]１.1表达序列标签(expressedsequencetags,ESTs)表达序列标签，是通过随机挑选cDNA文库进行单向测序得到的序列,长度一般在60-500bp,并且携带有表达基因的部分遗传信息[6]。该技术是最早用来研究转录组的方法,因具有快速、高效、信息含量大和通用性好等优点，而被广泛运用到植物表达谱研究[7]、构建遗传学图谱[8]、“电子”基因克隆、基因表达研究[9]以及分子遗传标记（单核苷酸多态性、简单序列重复片段和限制片段长度多态性等分子标记）[10-12]中。１.2基因表达系列分析技术（SAGE）和大规模平行测序技术（MPSS）SAGE是基于短序列测序的转录组研究方法，是Velculescu等[13]在1995年首次建立的一种高通量、高效、快速分析基因表达谱的开放性差异基因表达技术。该技术无须知道物种的基因组信息,便能够整体地检测所有转录本的表达水平，这对发现低拷贝基因有着重要意义[14]。SAGE现已成功地应用于植物及病原真菌等研究领域。例如美国科学家于2000年研究了大豆功能基因组学，其目的在于开发可用于大豆全基因表达分析的有力工具，将SAGE与微列阵相结合,以获得大豆不同组织、不同发育阶段以及不同处理条件下的基因表达数据库[15]。Mitchell[16]等人2003年利用SAGE技术对水稻与稻瘟病菌之间相互识别及病理反应进行全基因组分析，旨在了解与病原菌致病力和寄主抗性相关的基因，并从病菌中确定那些与植物互作相关的蛋白质，创建了50000个随机产生的病菌突变体，以求确定与复制和致病力有关的基因。水稻和稻瘟病基因组序列的公布，为阐明水稻和稻瘟病互作的分子机制创造了便利条件。基于SAGE技术的改进，大规模平行测序技术(massivelyparallelsignaturesequencing,MPSS)由Brenner等[17]2000年建立，成为一种新型基因克隆技术，可以获得更长的短标签序列，从而提高转录本的精准确度。另外，MPSS技术特有的微球荧光测序还可以直接高通量读出序列[18,19]。并且它还是一个数字表达系统，不必预先知道基因的序列，就能够在短时间内检测到细胞或组织内几乎所有基因的转录情况，尤其对那些表达水平较低、差异较小的基因非常有效,被认为是功能基因组研究的有效工具。但是,这两种技术过程中包含了酶切、克隆或杂交等繁琐步骤,这些步骤可能会导致序列出现碱基偏向性，从而影响转录本的正确性[20]。１.3基因芯片(Microassay)技术基因芯片是基于核酸杂交的一种转录组研究技术，其利用红、绿荧光染料分别标记实验样本和对照样本cDNA，混合后与基因芯片杂交，可显示实验样本和对照样本基因的表达强度[21]。目前，基因芯片主要应用于基因表达检测、寻找新基因、DNA测序、基因突变、多态性分析及基因文库作图等方面研究。基因芯片技术的优点是此法比较成熟,能够准确地检测较高表达的基因。主要缺点是杂交背景高，受基因拷贝数的限制，无法检测出低丰度基因；受数据库数据所限，可能出现注释错误。１.4数字基因表达谱技术（DGE）1997年，Audic和Claverie[22]首次提出了数字基因表达谱(digitalgeneexpressionprofiling，DGE)技术，其以高通量测序为基础，对标签直接进行测序，再将标签转化为数字化信号来反映基因的表达量[23]，能够全面、经济、快速地检测某一物种特定组织在特定状态下的基因表达情况。具有如下优势：信息数字化、能够检测未知基因的表达、能统计单拷贝及单碱基差异的标签以及发现新基因等。在黄瓜的水涝逆境分析中，QI等[24]采用DGE技术研究0h、2h、4h、8h和24h这5个时间点黄瓜根部的基因表达谱，其中主要参与碳代谢，光合作用，活性氧的产生/去除等方面的基因都有较大的差异表达，这将在转录水平上促进对黄瓜应答水涝胁迫的复杂机制的了解。１.5第二代高通量测序技术（RNA-seq）１.5.1第二代高通量测序技术简介以双脱氧终止法核酸技术（Sanger技术）为代表的第一代测序技术完成了人类基因组的绘制，此法在测序长度(可达1000bp)和碱基准确率(高达99.999%)有着明显的优势，但因其实验周期长，花费大和测序通量低,并不能满足在大规模测序中应用的需求[25-27]。随着生命科学的发展进入后基因组时代，应运而生的是新一代RNA-Seq技术(RNA-sequencing)，它可同时对数十万乃至数百万条DNA进行测序,被称为高通量测序；也可用于转录本研究，即检测总RNA或mRNA的技术，全面、深入和细致地分析一种生物的组织或细胞的基因组、转录组，因此又被称为深度测序[28]。转录组测序（RNA-Seq）是一种是指建立在新一代Illumina高通量测序平台()基础上的cDNA测序新兴技术，最初由BrianT.Wilhelm的研究团队[29]和UgrappaNagalakshmi的研究团队[30]分别在《nature》杂志和《science》杂志发表了利用RNA-Seq技术阐述裂殖酵母(fissionyeast)和酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)转录组的研究论文，标志着RNA-Seq技术的建立。RNA-Seq技术的建立，极大地推动了许多非模式植物、农作物和经济作物的全基因组测序工作。其首先是将所有的mRNA分子反转录成cDNA，然后进行测序得到大量reads,将这些reads进行拼接后与参考基因组比对，进而推断转录本的结构和表达情况。此技术能在单核苷酸水平对特定物种的整体转录活动进行检测[30]，从而全面快速地获得该物种在某一状态下的几乎所有转录本信息。该测序技术被认为是一种在转录水平上更为精确的测定分析方法，