第四章 植物脱毒技术

第四章植物脱毒技术一、引言多数农作物，特别是无性繁殖作物，都易受到一种或一种以上病原菌的周身浸染。例如，已知草莓能感染62种病毒和类菌质体，因而每年都必须更新母株。病原菌的侵染不一定都会造成植物的死亡，很多病毒甚至可能不表现任何可见症状。然而，在植物中病毒的存在会减少作物的产量和（或）品质。据报道，当以特定的无毒植株取代了被病毒侵染的母株之后，产量最多可增加300％（平均为30％）。因此，为了提高产量和促进活体植物材料的国际交换，根除病毒和其他病原菌是非常必要的。虽然通过杀细菌和杀真菌的药物处理，可以治愈受细菌和真菌侵染的植物，但现在还没有什么药物处理可以治愈受病毒侵染的植物。作物，特别是无性繁殖。由于大部分病毒都不是通过种子传播的，因此，若是使用未受侵染或侵染程度较轻的个体的种子进行繁殖，就有可能得到无病毒植株。不过有性繁殖后代常常表现遗传变异性，在园艺和造林业中，品种的无性繁殖十分重要，而这一般都是通过营养繁殖实现的。如果在一个品种中，并非全部母株都受到了侵染，那么只要选出一个或几个无病株进行营养繁殖，也有可能建立起无病的核心原种。但是，若一个无性系的整个群体都已受到侵染，获得无病植株的惟一办法，就是由该植株的营养体部分把病原菌消除，并由这些组织中再生出完整的植株。一旦获得了一个不带病原菌的植株，然后就可在不致受到重新侵染的条件下，对它进行营养繁殖。众所周知，病毒在植物体内的分布是不均匀的。在受侵染的植株中，顶端分生组织一般说或者是无毒的，或者是只携有浓度很低的病毒。在较老的组织中，病毒数量随着与茎尖距离的加大而增加。分生组织所以能逃避病毒的侵染，可能的原因是：①在一个植物体内，病毒易于通过维管系统而移动，但在分生组织中不存在维管系统。病毒在细胞间移动的另一个途径是通过胞间连丝，但它的速度很慢，难以追赶上活跃生长的茎尖；②在旺盛分裂的分生细胞中，代谢活性很高，使病毒无法进行复制；③倘若在植物体内确实存在着“病毒钝化系统”的话，它在分生组织中应比在任何其他区域都有更高的活性，因而分生组织不受侵染；④在茎尖中存在高水平内源生长素，可以抑制病毒的增殖。茎尖培养不但可以去病毒，而且可以去掉所有的病原菌(包括细菌、真菌等）二、通过热处理消除病毒基本原理，在高于正常的某一温度范围（35－40℃)下，植物组织中的很多病毒可被部分地或完全钝化，但很少伤害甚至不伤害寄主组织。热处理，可通过热水或热空气进行。热水对休眠芽效果较好；热空气对活跃生长的茎尖效果较好。处理时间的长短，可由几分钟到数周不等。例如，麝香石竹在38℃下处理2个月，从而消除了茎尖内的所有病毒。然而，马铃薯病毒X（PVX）则要求在35℃下处理几个月才能得到一些无病毒茎尖。热处理之后要立即把茎尖切下来嫁接到无病毒的砧木上去（这是对于难以生根的植物而言，易于生根的可以直接接到培养基上。热处理时，最初几天空气温度应逐步增高，直到达到要求为止。若钝化病毒所需要的连续高温处理会伤害寄主组织，则应当试验高低温交替的效果。在热处理期间应当保持适当的湿度和光照。而且要对植物进行修剪，以增加植物忍受热处理的能力。应用热疗法消除病毒的一个主要限制在于，并非所有的病毒都对热处理敏感，例如在马铃薯中，应用这项技术只能消除卷叶病毒（leafroolvirus）。和单独采用热疗法相比，茎尖培养具有更广泛的适用性。很多不能由单独的热处理消除的病毒，可以通过茎尖培养和热处理相结合，或单独的茎尖培养而消除。因而，茎尖培养现在已经成为消除病毒的一个很常用的手段。茎尖（shoottip),约0.1－1mm，多数是由茎尖培养得到去病毒植株。或者是茎的顶端分生组织（apicalmeristem)0.25mm以内。三、方法解剖镜（体视显微镜），解剖针，解剖刀。为了防止茎尖变干，要在衬有无菌湿滤纸的培养皿内进行解剖。茎尖外植体要用75％酒精浸蘸一下或0.1％的次氯酸钠消毒（10分钟）。在剖取茎尖时，要把茎芽置于解剖镜下，一手用一把细镊子将其按住，另一手用解剖针将叶片和叶原基剥掉。当形似一个透明闪亮的半球形顶端分生组织暴露出来之后，用一个锋利的长柄刀片将分生组织切下来，上面可以带有叶原基，也可不带，然后用同一工具接种到培养基上。对于难以生根的要嫁接到健康的砧木上。注意，不要太大，以免带有较老的组织。四、茎尖培养中影响脱毒效果的因素（一）培养基MS培养基是常用的较好的适于茎尖培养的培养基之一。下表是几种常用于茎尖培养的培养基。虽然较大的茎尖外植体（500μm）或更长在不含生长调节剂的培养基中也能产生一些完整的植株，但一般来说，含有少量（0.1－0.5mg/L的生长素或细胞分裂素或二者皆有常常是有利的。在各种不同的生长素中，应当避免使用2，4－D因为它通常能诱导外植体形成愈伤组织，广泛使用的生长素是NAA和IAA，其中NAA由于比较稳定，效果更好。（二）外植体大小在最适培养条件下，外植体的大小可以决定茎尖的存活率。外植体越大，产生再生植株的机会也就越多，在木薯中，只有200μm长的外植体能够形成完整的植株，再小的茎尖或是形成愈伤组织，或是只能长根。小外植体可能也不利于茎的生根。然而，不应当离开脱毒效率（它与外植体的大小呈负相关）单独看待外植体的存活率，因此，外植体应小到足以能根除病毒，大到足以能发育成一个完整的植株。除了外植体的大小之外，叶原基的存在与否也影响分生组织形成植株的能力。大黄离体顶端分生组织必须带有2～3个叶原基。Mrashige（1970）等虽然证实了不带叶原基的离体顶端分生组织有可能进行无限生长，并发育成完整的植株，但他们认为，叶原基能向分生组织提供生长和分化所必需的生长素和细胞分裂素。在含有必要的生长调节剂的培养基中，离体顶端分生组织可能在组织重建过程中迅速形成双极性轴。虽然培养不带叶原基的顶端分生组织是可能的，但对于脱毒来说，看来并不实际可行。正如Murashige所说的，“如果培养方法得当，用较大的茎尖做外植体，其消毒的效果并不一定比只用分生组织差。”（三）、培养条件在茎尖培养中照光培养通常都比暗培养的效果好。在马铃薯中建立茎尖培养物的最适光照强度是100lx，但4周后应增加到200lx。当茎已长到1cm高时，光照强度应进一步增加到4000lx。温度通常是25℃+2℃。(四)、外植体的生理状态茎尖最好是由活跃生长的芽上切取。在麝香石竹和菊花中，培养顶芽茎尖比培养腋芽茎尖效果好。但在草莓中Boxus（1977）没有看到这种差别。即使在腋芽比顶芽表现较差的情况下，为了增加脱毒植株的总数也还是要采用腋芽，这是因为腋芽在每个枝条上有好几个，而顶芽只有一个。取芽的时间也是个重要因素，这对于温带树种，植株的生长只限于短暂的春季，此后很长时间茎尖进行休眠，直到低温或光打破休眠为止。在这种情况下，茎尖培养应在春季进行，而若要在休眠期进行，则必须采用适当处理。在李属植物中，取芽之前必须把芽保存在4℃下近6个月之久。茎尖培养的效率除取决于外植体的存活率和茎的发育程度之外，还取决于茎的生根能力及其脱毒程度。在麝香石竹中，虽然冬季培养的茎尖产生的茎最易生根，但夏季得到无病毒植株的频率最高。在所研究过的大多数马铃薯品种中，在春季和初夏采集的茎尖比在较晚季节采集的容易生根。(五)、热疗法尽管顶端分生组织常常不带病毒，但不能把它看成一种普遍现象。现有足够证据表明，某些病毒实际上也能侵染正在生长的分生区域。若把茎尖培养和热疗法结合起来，也有可能获得脱毒植株。热处理可以在切取茎尖之前的母株上进行，也可以在茎尖培养期间进行。应用前一个方法还有一个有点，即由受热处理之后的母株上，可以切取较大的外植体进行培养，因而可以增加能够存活并发育成无病毒植株的茎尖的百分数。在草莓中将热处理（36℃，6周）与茎尖培养结合起来，比单独茎尖培养对于消除温性黄边病菌和其他较稳定的病毒更有效。在大多数草莓品种中，热处理还能提高植株的生长速率。但高温处理的时间要慎重决定，时间太长，对于植株有伤害。（六）通过愈伤组织培养消除病毒在由受感染的组织形成的愈伤组织中，并非所有的细胞都均匀一致的带有该种病原菌。已经由若干种植物的茎尖愈伤组织中再生出无病毒植株。在受病毒全面侵染的的愈伤组织中，某些细胞之所以不带病毒，可能是由于：病毒的复制速度赶不上细胞的增殖速度；有些细胞通过突变获得了抗病毒的特性。由受到TMV病毒感染的烟草叶片取下1mm的外植体进行培养，在生植株中有50％是无毒的。据报道，在马铃薯茎尖愈伤组织再生植株中，不含PVX植株的频率（46％）比由茎尖直接产生的植株中的频率要高得多。不过，在考虑采用愈伤组织培养消除病毒的时候，不能忽略培养细胞在遗传上的不稳定性，以及某些农作物还不能由愈伤组织再生植株。（七）脱毒效果的检验最简单的方法，是检验叶和茎是否有该种病毒所特有的可见病症。病毒的汁液感染法（saptransmission)是一种用于检验病毒的所有方法中最为敏感的方法，由受检植株上取下叶片，置于等容积（W/V）的缓冲液（0.1mol/L磷酸钠）中，用研钵和研杆将叶片研碎。在指示植物（对某种或某些特定病毒非常敏感的植物）的叶片上撒上少许600号金刚砂，然后用受检植物的叶汁轻轻涂于其上。适当用力摩擦，以使指示植物叶表面细胞受到感染，但又不要受伤叶片。大约5min后，用水轻轻洗去接种叶片上的残余汁液。把接过种的指示植物放在一间温室或防蚜虫罩内，株间以及与其他植物间都要隔开一定距离。取决于病毒的性质和汁液中病毒的数量，大概要6～8d或是几周，指示植物即可表现症状。在进行马铃薯的脱毒效果检验时常用的指示植物有千日红、苋色藜、野生马铃薯、曼陀罗、辣椒等等。不过，一些植物病毒，如草莓黄化病毒和丛枝病毒等，不是通过汁液传染的，而是通过蚜虫传播的，在这种情况下，则须将脱毒培养后的芽嫁接到指示植物上，根据指示植物的症状表现，判断是否脱除了病毒。检验植物中是否存在着病毒的其他方法，还有血清测验法和电镜观察法。对于不表现可见症状的潜伏病毒来说，血清法和电镜法是唯一可行的坚定方法。（八）通过茎尖培养消除病毒的注意事项要想得到和繁殖一个品种的脱毒植株，首先必须了解有关该种植物的一些背景知识，特别是可能周身侵染该种植物的病原菌以及这种植物的繁殖方法等。然后应当检查实验植物是否携带所疑有的病原菌，并确定茎尖外植体的适当大小，能导致生长最快和最有可能消除病毒的培养条件。最后反复检查茎尖产生的植株是否还带有疑有的病原菌，并在能杜绝任何再侵染可能性的条件下，繁殖那些确已脱毒的植株。脱毒的好处：一方面可以提高产量和品质；另一方面可以促进植物活体材料的进出口。除了掌握组培技术外还有懂得病理学和温室栽培学等的知识。马铃薯脱毒程序1．在正常的温度和光照条件下，在土中种一块单芽眼块茎，当第一个芽长到约15cm高时，将顶端切下6～8cm长。去掉下面的2个叶片，在切日处涂上生根激素后，把切条植人一个口径为10cm内装消毒土壤的花盆中，然后用玻璃烧杯罩上，保持10d。2．植人花盆3～4周后，将其移人生长箱中，其中光照强度为3000～4000lx，光照时间每天16h，气温白天约为36℃，夜间约为33℃。3．2周后打掉幼株的茎尖，以促使腋芽的生长。4．经过6周的热处理之后，折下1个腋生枝以从其上取芽，在植株上至少留下2个叶片以促其进一步生长。由折下的腋生枝上剪去叶片，但要把一小段基部叶柄留在枝上。把这个腋生枝包在湿纸内以防枯萎。5.双筒解剖镜下，将茎尖解剖出来（枝条不必消毒）。方法是：把残留的叶柄向后拉，使腋芽暴露出来，用一根解剖针剥掉幼叶。6．当只剩下2个最幼小的叶原基时，用装在一根合适刀把上的一小片碎刀片切下茎尖（300～600um长），放在培养基上。7．在23℃，每天16h光照的条件下培养。8.当茎长到3cm甚至更长并已生根时，即可移人土壤。起初要把植株保持在高湿度的环境中，若有些品种茎不生根，可以把它们嫁接到无病的砧木上去。9.移入土壤后，立即对植株进行第一次带病毒情况的检查，数周后再进行一次。马铃薯病毒的指示植物是千日红