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小檗碱影响断奶仔猪肠道区系的研究研究生：导师：主要内容1.立题依据和意义2.研究内容3.设计路线4.试验方案5.研究进度安排一、立题依据和意义•小檗碱（berberine，Ber）又名黄连素，属于季铵型异喹啉类生物碱，主要存在于小檗科、罂粟科、毛莨科、芸香科和防己科等植物中(何苗等,2012)。•小檗碱在乙醚中可析出黄色针状晶体，熔点为145℃，不溶于水，难溶于苯、乙醚和氯仿，其盐类在水中的溶解度比较小。•分子式为[C20H18NO4]+，分子量为336.37，结构如图1所示小檗碱具有广泛的抑杀细菌作用。Amin等测试了多种微生物对小檗碱的敏感性（表1）小檗碱的研究进展•郑红艳(2004)通过MOPAC/PM3方法优化，用Sybyl6.91软件进行分子叠加，发现小檗碱与喹诺酮类药物立体结构叠合较好，推测其可能有相同的抑菌作用机制。小檗碱的研究进展•小檗碱的季铵结构是抑菌活性所必须的结构，且C2、C3位上2个亚甲二氧基能够增强抑菌活性(郑多燕,2004)。小檗碱的研究进展小檗碱的研究进展•小檗碱能抑制细菌内糖代谢过程中的丙酮酸氧化，使细菌对维生素B6和烟酰胺等的利用受限制，产生抑菌作用（李仁利，2004）。•小檗碱能通过抑制细菌内的DNA、ＲＮＡ、蛋白质和类脂的合成，从而干扰细菌的繁殖（张明发，2003）。小檗碱的研究进展•孟甄等（2003）用含新霉素、小檗碱等的培养基连续传代培养大肠杆菌，结果在含新霉素条件下很容易出现耐药性菌株，而小檗碱组则没有出现耐药性菌株。•小檗碱对肠道对肠道常驻菌有弱抑制作用，其中对有害肠菌有较强的的抑制作用，而对乳酸菌等肠道常驻菌抑制作用较弱（Chae,1999）。小檗碱的研究进展•断奶仔猪日粮中添加三颗针提取物（有效成分主要为小檗碱）能减少仔猪腹泻、提高仔猪生长性能，达到或超过添加土霉素的促生长效果；与添加抗生素相比，三颗针提取物能改善断奶仔猪的免疫力，提高仔猪的特异性免疫和非特异性免疫机能，调节仔猪的肠道菌群，增加肠道乳酸杆菌和厌氧菌的数量，降低大肠杆菌和需氧菌的数量，提高肠道VFA的浓度（刘岭，2006）。小檗碱的研究进展•小檗碱可消除细菌的耐药质粒。在体外细菌培养和小鼠体内注射小檗碱，均可使多重耐药性痢疾杆菌的耐药质粒消除(杨春梅等,2000)。•小檗碱能够穿透磷脂双分子膜和金葡萄球菌细胞膜，是一种穿透性阳离子和多药耐药泵作用物(Severinaetal.,2001)。小檗碱的其他药理作用•小檗碱及其衍生物药理功能十分丰富，除抗菌、抗疟等活性外，小檗碱及其衍生物还具有抗病毒、治疗肿瘤、心血管疾病、降糖、调脂等多方面药理活性作用（张韶湘等，2007）。研究目的与意义•在实际生产中，断奶仔猪处于断奶（心理）、更换饲料（营养）双重应激，也是疫苗的集中免疫期和疾病的多发期。本试验通过在断奶仔猪饲料中添加小檗碱，研究其对仔猪肠道区系的影响，以期评估小檗碱作为潜在新型饲料添加剂的价值。二、研究内容•在21日龄断奶仔猪日粮中添加小檗碱，研究小檗碱对断奶仔猪肠道区系的影响。•通过对试验仔猪血清生理生化指标、腹泻率、腹泻指数、肠道HE染色肠绒毛高度、肠道微生物区系（高通量测序）的分析，评估小檗碱在断奶仔猪日粮中使用价值。三、技术路线40头仔猪随机分为A、B、C、D四组，每组10头A组仔猪不断奶B组21日龄断奶日粮不加小檗碱另外C、D两组分别在日粮中添加高、低两个浓度的小檗碱试验期2周，测定指标：血清生理生化指标，腹泻率，腹泻指数，肠道HE染色肠绒毛高度，肠道微生物区系（高通量测序）四、试验方案选取40头杜×（长×大）仔猪，随机分成4个处理组，每个处理组10头仔猪。分组情况如下：处理组一：21日龄不断奶；处理组二：21日龄断奶，仔猪基础日粮不加小檗碱；处理组三：21日龄断奶，仔猪基础日粮加低剂量小檗碱(300mg/kg)；处理组四：21日龄断奶，基础日粮加高剂量小檗碱(500mg/kg)。试验期14天。试验期管理•试验仔猪除接受处理日粮外，其他饲养管理、日常消毒和免疫程序均按规模化猪场统一执行。测定指标在试验期第7d和14d每组随机抽取3头仔猪屠宰。采血，采集10ml血样，室温下静置3-4h后3500r/min离心15min，制备血清-20℃保存备用；取肠道内容物和小肠组织样样品于-80℃保存。测定指标2、腹泻率每天8:00时定时观察仔猪粪便情况，粪便分为正常、稀软、粘稠、水样和血便5各等级，后四个等级为腹泻，记录每组腹泻头次。腹泻率=试验期腹泻仔猪头次／(试验仔猪头数×试验天数)×100％1、血清生理生化指标对血清样品进行血常规测定。测定指标3、腹泻指数M.Castillo,2008测定指标5、肠道微生物区系对肠道内容物样品进行高通量测序，分析肠道菌群区系。4、肠道HE染色长绒毛高度各肠段样本采用石蜡切片，苏木精-伊红染色，在光学显微镜下进行观察、采图和测量小肠绒毛高度。五、研究进度安排•2016.03~2015.9动物试验•2016.10~2016.11实验室分析•2016.11~2017.04数据整理与论文撰写•2017.05~2017.06论文答辩请各位老师批评指正！小檗碱的药理作用杨庆珍（2015）对小檗碱的药理作用研究进展进行了统计，见下表2（杨庆珍，2015）小檗碱的药理作用小檗碱的药理作用