基因工程绪论

基因工程GeneEngineering第一章绪论什么是基因（gene）第一节基因研究历史1866年，孟德尔（G.J.Mendel）提出了遗传因子（hereditaryfactor）的概念。他将控制豌豆性状的遗传因素称之为遗传因子形成了基因的雏形。第一节基因研究历史豌豆杂交操作孟德尔研究的七对性状孟德尔分离律1909年，丹麦的遗传学家W.Johanssen根据希腊语“给予生命”之义，创造了“gene”一词（我国著名遗传学家谈家桢将其翻译作“基因”），代替孟德尔的hereditaryfactor。但它只是一个抽象的代表遗传性状的符号，并不代表物质实体。第一节基因研究历史“遗传因子/基因”的设想一经提出，便推动人们去寻找，去探索基因在哪里？基因是什么？第一节基因研究历史显微镜技术与染色技术的发展，使人们注意到，细胞分裂时，尤其是减数分裂中，染色体的行为和孟德尔提出的等位基因的分离规律相当一致，所以，确定基因在细胞核中，在染色体上。第一节基因研究历史1910年，美国遗传学家摩尔根（T.H.Morgan）以果蝇为研究材料，发现了连锁交换定律并提出遗传粒子学说，第一次将代表某一特定性状的基因与某一特定的染色体联系起来，即基因位于染色体上。Morgan理论的重要性在于基因不再是抽象的符号，而是与染色体紧密相关的一个实体。第一节基因研究历史1928，F.Griffith细菌转化实验1944年，美国洛克菲勒研究所的OswaldAvery等公开发表了改进的肺炎双球菌实验结果。（1）S型菌细胞提取物及其纯化的DNA都可使R型菌转变成S型菌；（2）经DNase处理的S型菌细胞提取物失去了转化作用。（3）经胰蛋白酶处理的S型菌细胞提取物仍有转化作用。不仅证实了DNA是遗传物质，而且证明了DNA可以将一个细菌的性状转给另一个细菌，他的工作被称为是现代生物科学的革命性开端。第一节基因研究历史Hershey&Chase分别用放射性同位素标记噬菌体35S－标记蛋白质32P－标记DNA35S标记外壳蛋白质,感染后放射标记不进入大肠杆菌细胞32P标记DNA,感染后放射标记进入大肠杆菌细胞1953年，J.Watson和F.Crike创立DNA双螺旋模型，证实基因是具有一定遗传效应的DNA片段。第一节基因研究历史ABZDNA双螺旋模型说明DNA分子能够充当遗传的物质基础。按照双螺旋模型，在细胞分裂时，DNA的合成应是“半保留复制”的模式。第一节基因研究历史半保留复制1960年，F.Jacob和J.Monod提出了操纵元（操纵子）的概念，揭示了原核生物基因表达调控的重要规律。第一节基因研究历史基因的现代概念移动基因（movablegene）断裂基因（splitgene）假基因（pseudogene）重复基因（repeatedgenes）重叠基因（overlappinggenes）或嵌套基因（nestedgenes）第一节基因研究历史基因的特点:基因是实体，不同基因具有相同的物质基础——核酸（DNA或RNA）基因携带遗传信息，通过复制可以把遗传信息传递给下一代遗传密码在生物界是通用的概括说来，基因是含有特定遗传信息的核酸序列，是遗传物质的最小功能单位第一节基因研究历史基因和蛋白的关系一条基因一个蛋白OR一个蛋白一条基因？编码蛋白的基因只转录而无翻译功能的基因（tRNA，rRNA）不转录的基因第一节基因研究历史第一章绪论第一节基因研究历史第二节基因工程的诞生第三节基因工程的基本概念与内容第四节基因工程的安全性第五节基因工程的应用第六节基因工程的商业化发展。1944年，AveryO.T.利用肺炎双球菌转化实验证明了DNA是遗传物质一、基因工程诞生的理论基础第二节基因工程的诞生1.DNA是遗传物质1953年JamesD.Watson和FrancisH.C.Crick揭示了DNA分子的双螺旋结构和半保留复制机制。解决了基因的自我复制和传递问题Watson和Crick2.DNA双螺旋结构一、基因工程诞生的理论基础第二节基因工程的诞生既然，DNA是遗传信息的载体，那么它是如何传递遗传信息的呢？遗传信息又是如何控制生物的表型性状的呢？以Nireberg等为代表的一批科学家经过艰苦的努力，确定了遗传信息以密码方式传递，每三个核苷酸组成一个密码子，代表一个氨基酸，到1966年，全部破译了64个密码子，并提出了遗传信息传递的“中心法则”。3.中心法则和遗传密码——遗传信息传递机制第二节基因工程的诞生a.遗传密码是通用的b.基因可以通过复制把遗传信息传递给下一代三联密码子同氨基酸间的对应关系，在所有生物中都是相同的：重组ＤＮＡ分子→导入生物中只要具备转录和翻译的条件→合成出原样的氨基酸经重组的基因一般是能传代的，可以获得相对稳定的转基因生物第二节基因工程的诞生这三大发现大大促进了生命科学的迅速发展，为基因工程的诞生奠定了重要的理论基础．1970年H.O.Smith等分离并纯化了限制性核酸内切酶HindII，1972年，Boyer等相继发现了ＥcoRI一类重要的限制性内切酶。WernerArber1968年发现限制酶1.工具酶的发现与应用二、基因工程诞生的技术突破第二节基因工程的诞生1967年，世界上有五个实验室几乎同时发现DNA连接酶，特别是1970年Khorana等发现的T4DNA连接酶具有更高的连接活性。1.工具酶的发现与应用第二节基因工程的诞生第二节基因工程的诞生1970年，Baltimore等和Temin等各自发现了反转录酶，完善了中心法则，使真核基因的制备成为了可能。2.反转录酶的发现与应用第二节基因工程的诞生1972年前后使用小分子量的细菌质粒和噬菌体作载体。在细菌细胞里的大量扩增。3.载体的发现与应用第二节基因工程的诞生1973年，Stanford大学的Cohen等成功地利用体外重组实现了细菌间性状的转移。这一年被定为基因工程诞生的元年。3.载体的发现与应用第二节基因工程的诞生证明DNA是遗传物质发现DNA双螺旋结构破译遗传密码限制性核酸内切酶的发现DNA连接酶的发现逆转录酶的发现质粒等载体的发现基因工程的诞生1944，艾弗里1953，沃森和克里克1963，尼伦贝格1970，阿尔伯、内森斯、史密斯1970年M.Mandel和A.Higa发现经过氯化钙处理的大肠杆菌容易吸收噬菌体DNA。1972年S.Cohen发现这种处理过的细菌同样能吸收质粒DNA。4.感受态体系第二节基因工程的诞生1960s发明了琼脂糖凝胶电泳，可将不同长度的DNA分离开。1975年F.Sanger、A.Maxam和W.Gilbert发明了DNA快速测序技术。1980年Nobel化学奖5.琼脂糖凝胶电泳6.DNA测序技术第二节基因工程的诞生1980年Nobel化学奖1972年斯坦福大学的PaulBerg小组完成了首次体外重组实验：用EcoＲI内切酶消化猿猴病毒SV40的DNA和噬菌体的DNA，再用T4DNA连接酶将其连接起来。1.Berg的开创性实验四、基因工程的诞生第二节基因工程的诞生1973年斯坦福大学S.Cohen小组将含有新霉素抗性基因的大肠杆菌R6-3质粒与含有四环素抗性基因的质粒pSC101连接成重组质粒，转化获得具有双重抗药性的大肠杆菌。后来又把非洲爪蟾核糖体基因片断同pSC101质粒重组，转化大肠杆菌，并在菌体内成功转录出相应的mRNA。这是第一次成功的基因克隆实验。2.Boyer-Cohen实验第二节基因工程的诞生Boyer-Cohen实验1、PSC101可以做为载体，将外源DNA导入寄主细胞2、真核生物的基因可以转录到原核生物3、质粒-大肠杆菌是成功的基因克隆体系此实验说明：第二节基因工程的诞生1973年为基因工程元年基因工程的发展（一）基因工程的艰难阶段（二）基因工程的逐渐成熟阶段（三）基因工程的迅速发展阶段第二节基因工程的诞生基因工程的逐渐成熟阶段1977年，日本科学家首次在大肠杆菌中克隆并表达了人生长激素释放抑制素基因，首次实现真核基因的原核表达。随后，美国的Ullvich克隆并在大肠杆菌中表达了人胰岛素基因。1978年，美国Genentech公司开发出利用重组大肠杆菌合成人胰岛素的生产工艺。第二节基因工程的诞生迅速发展阶段1982利用显微注射法培育转基因小鼠1983利用农杆菌介导法培育转基因烟草1990美国政府批准对一名因腺苷脱氨酶基因缺陷而患有重度联合免疫缺陷症的儿童进行基因工程治疗，获得成功。1991人类基因组计划启动1986-1998，共有4387项转基因植物批准进入田间试验。1997克隆羊“多莉”诞生。第二节基因工程的诞生克隆羊“多莉”第一章绪论第一节基因研究历史第二节基因工程的诞生第三节基因工程的基本概念与内容第四节基因工程的安全性第五节基因工程的应用第六节基因工程的商业化发展经典定义重组DNA技术是指将一种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿稳定遗传并表达出新产物或新性状的DNA体外操作程序，也称为分子克隆技术。因此，供体、受体、载体是重组DNA技术的三大基本元件。第三节基因工程的基本概念与内容基因工程是指重组DNA技术的产业化设计与应用，包括上游技术和下游技术两大组成部分。上游技术指的是基因重组、克隆和表达的设计与构建（即重组DNA技术）；下游技术则涉及到基因工程菌或细胞的大规模培养以及基因产物的分离纯化过程。第三节基因工程的基本概念与内容基因工程的别名操作环境操作对象操作水平基本过程结果实质DNA重组技术生物体外基因DNA分子（基因）水平人类需要的基因产物剪切→拼接→导入→表达基因重组第三节基因工程的基本概念与内容基因工程最突出优点——跨物种基因工程的诞生是分子生物学研究发展的必然产物，它使得体外DNA遗传操作成为现实，从而可以绕过物种远缘有性杂交的鸿沟，使基因在微生物、植物、动物之间交流，迅速并定向的获得人类需要的新的生物类型。为大规模生产生物分子，设计构建新物种，搜集、分离、鉴定生物信息资源提供了极大的便利。第三节基因工程的基本概念与内容基因能够在物种间转移的理论依据是什么？是生物界遗传密码的通用性、简并性和碱基配对的一致性第三节基因工程的基本概念与内容重组DNA技术与基因工程的基本用途分离、扩增、鉴定、研究、整理生物信息资源大规模生产生物活性物质设计、构建生物的新性状甚至新物种第三节基因工程的基本概念与内容第一代基因工程(经典基因工程)蛋白多肽基因的高效表达第二代基因工程(蛋白质工程)蛋白编码基因的定向诱变第三代基因工程(途径工程)代谢信息途径的修饰重构第四代基因工程(基因组工程)基因组或染色体的转移基因工程的基本形式第三节基因工程的基本概念与内容基因工程在生物工程中的学科地位工程细胞细胞工程基因工程蛋白质工程途径工程发酵工程细胞工程分离工程酶酶工程分离工程野生细胞野生细胞生物活性物质生物活性物质从复杂的生物基因组中，经过酶切消化或PCR扩增等步骤，分离出带有目的基因的DNA片断。将目的基因的DNA片断插入到能自我复制并带有选择性标记（抗菌素抗性）的载体分子上。1.目的基因的获取2.重组体的制备切接基因工程的基本操作步骤将重组体（载体）转入适当的受体细胞中。对转入重组子的受体细胞进行培养,以扩增DNA重组子或使其整合到受体细胞的基因组中。3.重组体的转化4.重组子的培养增转第三节基因工程的基本概念与内容使导入寄主细胞的目的基因表达出我们所需要的基因产物。基因工程的操作过程可简化为:挑选转化成功的细胞克隆（含有目的基因）。5.克隆的鉴定6.目的基因的表达检第三节基因工程的基本概念与内容基因工程研究的主要内容（一）基础研究构建克隆载体及相应的表达系统、不同物种的基因组文库和cDNA文库、开发新的工具酶、基因工程新技术、新的操作方法。第三节基因工程的基本概念与内容（二）克隆载体研究基因工程的发展是与克隆载体构建密切相关的；Ti质粒的发现使植物基因工程研究迅速发展起来；动物病毒克隆载体的构建，使动物基因工程研究