微生物代谢控制发酵(第三章)

微生物代谢控制发酵王腾飞[e-mail]13869144397第三章微生物代谢控制发酵第一节代谢控制发酵的基本思路第二节微生物代谢控制发酵的措施第三节环境条件的控制第一节代谢控制发酵的基本思路应用营养缺陷型突变株切断代谢支路；渗漏突变株的应用；抗结构类似物突变株的应用；营养缺陷型回复突变株的应用；增加前体物质的合成；增加细胞渗透性，去除细胞内的终产物；一些特殊调节机制的利用；条件突变株的应用；选育不生成副产物的菌株。代谢控制发酵工程能否获得成功，目的产物产量的高低，取决于微生物细胞自我调节控制是否能够解除或解除的程度。能否解除微生物的自我调节控制机制，而使代谢产物大量积累是代谢控制发酵育种的关键。菌体及终端产物初级代谢产物（如酶类）次级代谢产物（如抗生素）大分子合成素材性产物外源基因产物基因改造基因导入从易到难1微生物终端产物:乳酸、酒精、CO2、乙酸、丙酮丁醇、酵母等。2微生物生长自身必须的产物，如，糖化酶、蛋白酶、果胶酶等。3微生物的次级代谢产物，如抗生素等4素材性中间代谢产物，如，氨基酸、核苷酸、有机酸、核糖、乙酰辅酶A等，获得这些物质必须在遗传水平上打破微生物自身的代谢调节机制.5微生物自身不能合成，自身也不需要的外源基因产物。微生物代谢途径中获得的产物菌种选育代谢控制发酵过程控制产品提纯ACDFEDB“五字方针”:进、通、节、堵、出相关的常用名词营养(nurture)：生物体获得的或合成的营养素。基本培养基（minimalmedium）:野生型菌株（原养型）可以生长而该菌株的一切营养缺陷型均不能生长的培养基。完全培养基（Completemedium）:所含有的营养成分足以供给原养型和营养缺陷型菌株的生长的培养基。常用于菌种的选育和微生物遗传学研究等。加富培养基，enrichedmedium:又称富集培养基。一般为在普通培养基中加入额外的营养物质的培养基。加入的额外营养物质诸如血、血清、动植物或微生物细胞的提取物等营养丰富物质。常用于菌种筛选中，使所筛选的微生物在其中生长比其它微生物迅速而淘汰掉其他微生物。结构类似物与代谢途径中的代谢产物结构相类似，能与代谢物一样与调节酶结合引起酶活性的变化，但不具有代谢物生理功能的一类化合物。营养缺陷突变株(Auxotroph)指原菌株由于发生基因突变，致使合成途径中某一步骤发生缺陷，从而丧失了合成某些物质的能力，必须在培养基中补加该营养物质才能生长的突变型菌株。渗漏型突变株指遗传性障碍不完全的缺陷型。由于这种突变是它的某一种酶的活性下降而不是完全丧失，因此，渗漏缺陷型能够少量地合成某一代谢最终产物，能在基本培养基上进行少量的生长代谢互锁Metabolicinterlock一种代谢产物的代谢调节，受来自另外一种从生物合成途径来看似乎完全无关的终产物的控制，这种现象叫代谢互锁（一）、切（阻）断支路代谢措施：选育营养缺陷突变株选育渗漏缺陷突变株AFDCBEE不能合成,加入E,微生物生存解除F的反馈调节大量合成D1、营养缺陷菌株的应用①合成途径中某一步骤发生缺陷，致使终产物不能积累②实质上（遗传性的）解除了终产物的反馈抑制或反馈阻遏③中间产物或另一分支途径的末端产物得以积累④对某一产物的积累，起到节约碳源的作用需要添加缺失的该物质才能在基本培养基上生长5，-肌苷酸二钠（IMP)5，-肌苷酸二钠又名肌苷酸钠，简称5‘-IMP，为白色结晶或结晶性粉末，含有约7.5分子结晶水。无臭，有特别强的鲜味。营养缺陷型应用举例（一）肌苷发酵是通过代谢流的堵塞来消除终产物的反馈调节，以达到中间产物的积累的。枯草芽胞杆菌嘌呤核苷酸生物合成的调节机制在枯草芽胞杆菌的嘌呤核苷酸生物合成中，有几个部位受到产物的反馈调节，催化这些步骤的酶都是变构酶。PRPP合成5/-磷酸核糖胺途径中的酶受AMP、GMP的反馈抑制，并且二者在抑制该酶活性中有互相增效的作用。IMP是AMP、GMP合成途径的分支点，分别接受AMP和GMP的反馈调节。即在AMP合成中，专一性酶腺苷琥珀酸合成酶（SAMP合成酶）仅受AMP系物质的反馈阻遏；在GMP合成中，专一性酶（IMP脱氢酶）仅受GMP系物质的反馈阻遏和反馈抑制。枯草芽胞杆菌嘌呤核苷酸生物合成的调节机制肌苷酸发酵腺嘌呤缺陷型（Ade-）黄嘌呤缺陷型（Xan-）鸟嘌呤缺陷型（Gua-）5－磷酸核糖焦磷酸PRPP谷氨酰胺PRPP转移酶5－磷酸核糖胺肌苷酸腺嘌呤核苷琥珀酸SAMP黄嘌呤核苷酸XMP腺嘌呤核苷酸AMP鸟嘌呤核苷酸GMP肌苷（IR）次黄嘌呤核苷5’-IMP枯草芽孢杆菌当选用腺嘌呤缺陷型（Ade-）时，由于切断了IMP到AMP这条代谢支路，通过在培养基中限量控制腺嘌呤的含量，就可以解除腺嘌呤系化合物对PRPP转酰氨酶的反馈调节，因而可使肌苷酸得到积累。在腺嘌呤缺陷型（Ade-）的基础上，若再诱变得到黄嘌呤缺陷型（Xan-）或鸟嘌呤缺陷型（Gua-），就可以切断IMP到GMP代谢支路，通过在培养基中限量控制黄嘌呤或鸟嘌呤的含量，就可以解除鸟嘌呤系化合物引起的反馈调节，从而增加肌苷酸的积累。必需氨基酸：赖氨酸（Lys）、色氨酸（Trp）、苯丙氨酸（Phe）、蛋氨酸（Met）、苏氨酸（Thr）、亮氨酸（Leu）、异亮氨酸（Ile）、缬氨酸（Val）。营养缺陷型应用举例（二）赖氨酸为碱性必需氨基酸。由于谷物食品中的赖氨酸含量甚低，且在加工过程中易被破坏而缺乏，故称为第一限制性氨基酸。原理：在分支合成途径中，由于存在着多个终产物单独存在时都不能对其合成途径的关键酶实现全部的反馈抑制或阻遏的现象，故可以利用这种机制选育营养缺陷型菌株，造成一个或两个终产物合成缺陷而使另外的终产物得以积累。赖氨酸生产菌株有：谷氨酸棒杆菌；北京棒杆菌；黄色短杆菌等。合成苏氨酸蛋氨酸的途径的关键酶天冬氨酸激酶是单一酶，受苏氨酸（Thr）和赖氨酸（Lys）协同反馈抑制。苏氨酸和赖氨酸单独一种存在时不受抑制，仅当两者共存并都过量时才起抑制作用。谷氨酸棒杆菌Lys合成途径葡萄糖天冬氨酸↓AK↓天冬氨酰磷酸↓天冬氨酸半醛PS↙↘HD二氨基庚二酸(DAP)高丝氨酸（Hom)↓↙HK↘赖氨酸(Lys)苏氨酸(Thr)蛋氨酸(Met)↓异亮氨酸AK天冬氨酸激酶；PS二氢吡啶二羧酸合成酶HD高丝氨酸合成酶；HK高丝氨酸激酶高丝氨酸缺陷型菌株缺失HD酶限量添加高丝氨酸协同反馈抑制赖氨酸生产菌株的调节机制赖氨酸生产菌株合成赖氨酸、苏氨酸、蛋氨酸的途径的调节机制与大肠杆菌不同。E.coli的关键酶天冬氨酸激酶是同工酶。而上述菌种的关键酶天冬氨酸激酶不是同工酶，是单一酶，该酶受苏氨酸（Thr）和赖氨酸（Lys）的协同反馈抑制，即天冬氨酸激酶在赖氨酸或苏氨酸单独存在时不受抑制，只有当两者共同存在且都过量时才起抑制作用。利用高丝氨酸营养缺陷型（Hom-）或苏氨酸营养缺陷型（Thr-）菌株可以使赖氨酸得到积累因此，在苏氨酸限量培养时，即使赖氨酸过剩，也能进行由天冬氨酸生成天冬氨酰磷酸的反应。在苏氨酸缺陷型中，天冬氨酸半醛可以进一步转变为赖氨酸和高丝氨酸，高丝氨酸又进而转变为蛋氨酸，却不能生成苏氨酸。在高丝氨酸营养缺陷型中，由于缺乏催化天冬氨酸-β-半醛成为高丝氨酸的高丝氨酸脱氢酶，因而菌株丧失了合成高丝氨酸的能力。这样，一方面切断料生物合成苏氨酸和蛋氨酸的支路代谢，使中间产物——天冬氨酸半醛全部转入赖氨酸的合成；另一方面，通过限量添加高丝氨酸，可使蛋氨酸、苏氨酸限量产生，因而就解除了蛋氨酸、苏氨酸对天冬氨酸激酶的协同反馈抑制，使赖氨酸得以大量积累。2、渗漏突变株的应用特点：1解除了反馈调节；2在基本培养基上生长；3积累其他分支途径的终产物。优点：在发酵过程中不需要添加营养缺失的物质。渗漏缺陷型就是指遗传性障碍不完全的缺陷型。由于这种突变是它的某一种酶的活性下降而不是完全丧失，因此，渗漏缺陷型能够少量地合成某一代谢最终产物，能在基本培养基上进行少量的生长。调节模式——同营养缺陷型（二）、选育抗结构类似物突变株结构类似物的性质：①结构类似物的结构与代谢产物结构相似，能与阻遏蛋白或变构酶相结合，使氨基酸、核苷酸、蛋白质等的合成途径关闭或启动，或抑制关键酶的活性；②结构类似物在生物学性质上不能代替代谢物。不能参与蛋白质、核酸等生物大分子的合成。③不具有代谢物生理功能的一类化合物。抗结构类似物突变株也称为代谢拮抗性突变株，即诱发突变中产生的一些对高浓度的代谢产物类似物不敏感的突变株，这些突变株既然能抗高浓度结构类似物的抑制和阻遏，也就能抗高浓度代谢终产物的反馈抑制和阻遏。①因为抗类似物突变株的代谢调节可以被遗传性地解除，故在发酵生产时可不再受培养基中成分的影响，生产较稳定。②抗类似物突变株不易发生回复突变，因此，在发酵生产上被广泛采用。3．抗结构类似物突变株的优点正常的合成代谢的最终产物能与阻遏蛋白以及变构酶相结合，它对于有关的酶的合成具有阻遏作用，对于合成途径的第一个酶具有反馈抑制作用。它与酶的结合是可逆的。故当细胞中代谢终产物的浓度降低时，它就不再与阻遏物以及变构酶结合，这时有关的酶的合成以及它们的催化作用便又可继续进行。由于结构类似物与代谢最终产物结构相似，故它也能与阻遏物以及变构酶结合，但它们不能代替正常的氨基酸而合成蛋白质，即它们在细胞中的浓度没有降低，因此与阻遏物以及变构酶结合是不可逆的，是有关的酶不可逆地停止了合成，或是酶的催化作用不可逆地被抑制。4．结构类似物的作用机制D/是D的结构类似物，一般情况下，D反馈抑制或阻遏A→B的限速酶。当在培养基中加入D/时，D/与酶蛋白结合，抑制A→B的反应。抗结构类似物突变株就是对目的产物的结构类似物有抗性的菌株，以达到该菌株不受终产物D反馈抑制或阻遏的效果，使D大量积累。5.一个菌株如何成为抗类似物突变株的？一个具有正常代谢的微生物，其代谢产物的结构类似物不可逆的抑制了或阻遏了合成该代谢产物的合成酶类，使菌体不能正长，直至死亡。抗结构类似物突变株，其代谢失常，结构类似物不能与关键酶或阻遏蛋白结合而改变酶的活性。可以使合成途径不能受到终产物的抑制，因此，终产物可以积累，该菌体处于非健康生长状态。这种突变株对高浓度终产物的反馈抑制不敏感是因为编码酶蛋白的结构基因突变，使限速酶蛋白质的性质发生了变化；对阻遏不敏感则是因为调节基因或操纵基因突变，使阻遏蛋白与操纵基因的亲和力发生了变化。在抗代谢物的上方注一“r”，如抗D-Arg的突变株以D-Argr表示，即L-精氨酸抗株。6．抗结构类似物突变株的表示方法7．Xr突变株的选育方法抗性突变株的最常用的选育方法是梯度平板法，即将一定浓度的代谢类似物加入到培养基中，制成浓度梯度平板，将诱变的菌液涂布到平板上，经过培养可出现三种情况：（1）结构类似物浓度太低，不能抑制菌株生长；（2）结构类似物浓度太高，全部抑制，菌株不能生长；（3）结构类似物浓度适中，有少数耐结构类似物的突变株生长，可再经进一步分离纯化及经济性状鉴定，既可作为生产菌种。Xr突变株的选育示意图S－（ɑ－氨基乙酸）-L-半胱氨酸；AEC-Lys；AHV-Thr；MetHxr-Met；几乎所有的氨基酸和核苷都可以通过采用抗结构类似物突变株的方法进行发酵生产。对于生物合成途径已弄清的目的产物，当不能从野生型、营养缺陷型得到生产菌株时，抗结构类似物突变株是一条重要的选择途径。8．常用的结构类似物9．抗结构类似物突变株应用举例精氨酸（Arg）发酵是利用抗结构类似物突变株进行的。从谷氨酸合成精氨酸一共经过8个酶促反应，当有精氨酸存在时，这些酶的合成都处于被阻遏状态，此外，精氨酸的生物合成还要受到精氨酸本身的反馈抑制。谷氨酸棒杆菌Coynebacterumglutamicum谷氨酸N-乙酰谷氨酸N-乙酰-γ-谷氨酰磷酸N-乙酰-谷氨酸γ-半醛N-乙酰鸟氨酸鸟氨酸瓜氨酸精氨琥珀酸精氨酸D-精氨酸抗性突变株精氨酸氧污酸盐