膜蛋白抽提

二、蛋白抽提谈及蛋白分离，我们想到：超速离心，盐析法、超滤法、凝胶过滤法、等电点沉淀法、离子交换层析、亲和层析、吸附层析、逆流分溶、酶解法……有时这些方法常常组合到一起对特定的物质进行分离纯化。由于蛋白质种类繁多，不同的蛋白质由于结构和组成的差异，其溶解度也各不相同.根据蛋白质的溶解特性，同时可选择不同的溶剂提取，分为水溶液提取和有机溶剂提取.但是针对膜蛋白的提取与细胞质蛋白，核蛋白提取不同之处在于它是嵌在膜中的，水溶性不好，基本方法就是用不同的离心速度去掉胞质蛋白等，最后用去污剂把蛋白从膜中释放出来。膜蛋白分离纯化的重要步骤是选择适当的增溶用表面活性剂，一般常用的有胆酸盐，CHAPS(一种离子去污剂），Emulgen和Lubrol等表面活性剂。1、分离膜蛋白的方法（原则性）：1）先分离膜，然后提取；如选用冷热交替法、反复冻融法、超声破碎法、玻璃匀浆法、自溶法和酶处理法使得细胞破碎，然后通过剃度离心得到含有膜蛋白的粗组分。（例如：michael11液氮研磨组织，加入匀浆缓冲液及蛋白酶抑制剂。差速离心。蔗糖密度梯度离心。收集37%与41%间的成分，即为质膜部分。裂解即可收集膜蛋白）2）用特殊的去污剂选择性的分离。从膜上提取蛋白有许多困难.在多数情况下，都是采用去垢剂将疏水蛋白从其膜结构中溶解下来，然后将蛋白质稳定.去垢剂的选择通常是依据他对所需要蛋白质的提取效率来确定，但在某些情况下，还要考虑到以后的纯化步骤.虽然许多膜蛋白必须在去垢剂存在的情况下进行纯化，但最终仍可能需要除去去垢剂.这常常会引起蛋白质失活，但如果蛋白质是用于测序的，他将不是一个问题.如果不是用于测序的，可考虑使用能够黏附去垢剂的疏水珠.许多文献和生化试剂供应商的产品目录中，都介绍有许多种不同的可用来溶解膜蛋白的去垢剂.然而，他们并不是普遍适用的.在设计膜蛋白溶解方案时，必须考虑某一去垢剂的特殊性质.如tritonX-100在280nm处有吸收，如果某蛋白质的测试与280nm处的吸收有关，就应避免使用这类去垢剂.将膜制剂与胞质蛋白及细胞核分离后，再进一步从细胞膜制剂中将所需的膜蛋白增溶下来.这种做法的好处是可以用强烈的去垢剂提取细胞骨架的相关蛋白，而无需考虑胞质蛋白、细胞核成分或染色质成分的混入.使用这种方法所获得的膜蛋白，无论在种类上还是数量上，都比酸溶解法所得到的蛋白（5000Da）要多.一般提取的膜蛋白量往往只占膜蛋白总量的不足0.1%，所以充分的膜蛋白的提取，无疑对于研究膜蛋白的结构和功能都是非常重要的.第二种方法简单，可靠，但有时含有其他蛋白。一般的都是利用4度时所有的蛋白质原则上都溶于TritonX114水溶液，在温度超过20度时，此溶液分为水相和去污相；此时亲水性蛋白溶于水相，疏水的膜蛋白溶于去污剂相中。利用此性质可提取膜蛋白。3)膜蛋白色谱(ChromatographyofMembraneProtein,CMP)CMP+分离强疏水性蛋白、多肽混合物的层析系统，一般有去垢剂（如SDS）溶解膜蛋白后形成SDS-融膜蛋白，并由羟基磷灰石为固定相的柱子分离纯化。羟基磷灰石柱具有阴离子磷酸基团（P-端），又具有阳离子钙（C-端），与固定相结合主要决定于膜蛋白的大小、SDS结合量有关。利用原子散射法研究cAMP的分离机制发现，样品与SDS结合后在离子交换柱上存在SDS分子、带电荷氨基酸与固定相中带电离子间的交换，从而达到分级分离的目的。层析柱提取（参步骤）4)顺序抽提法：根据细胞蛋白溶解性的差异，用具有不同溶解能力的蛋白溶解液进行抽提的方法。用Tris碱溶液裂解细胞提取高溶解性蛋白；把未溶解的pellet用标准液溶解提取高疏水性蛋白；最后用含复合表面活性剂的蛋白溶解液，最后可以再次抽提前两次抽提后不能溶解的膜蛋白。5)centrifugalproteinextraction原理：高渗的蛋白裂解液让细胞溶涨破裂后，超高速离心评价：尽管分级(胞浆和胞膜)之间有清洗的步骤,但是可溶蛋白组分和膜蛋白组分之间仍然有不少重复的点.该方法相较MOLLOYMP教授在1998年electrophoresis上发表的分级抽提法减去了第一步(用tris抽提水溶性蛋白)和最后一步(极难溶蛋白),在操作上也作了简化,总而言之是一种不错的方法。（codegreen）6)detergent-based：提取时先裂解液裂胞膜（选用不同的去污试剂是关键），梯度离心分离细胞器(ER)，然后分级抽提方法。例如，去掉细胞器之后的DEBRIS就是核膜，再裂解得到核膜蛋白。而膜蛋白是裂胞膜时不溶的部分。总的感受：细胞的量要很充足。之后的定性鉴定常用的方法有双向免疫扩散、免疫电泳及聚丙稀酰胺凝胶电泳等。纯化蛋白质浓度的定量测定可用双缩脲法、酚试剂法或紫外光吸收法定量鉴定膜蛋白，方便迅速。到目前为止，提取膜蛋白仍然是蛋白学的一个瓶颈。2、分离膜蛋白的方法（操作）1）分离细胞膜蛋白的方法：1冰上刮下细胞后将细胞溶于有蛋白酶抑制剂的缓冲液A中，于室温与液氮罐中反复冻融2次。25000转4度离心，驱除核及未裂解的细胞。3取上清12000转4度离心10分钟取沉淀溶于有蛋白酶抑制剂的缓冲液B中。412000转4度离心10分钟取沉淀溶于有蛋白酶抑制剂的缓冲液C中提取后测蛋白浓度,SDS-PAGE电泳，分装后-20度保存备用。bufferA:1mMkcl,5mMNacl,3mMMgcl2,50mMHepes,1mMDTT,0.5ug/mlLeupeptin,20uMpmsf(PH=7.4)bufferB:1mMkcl,5mMNacl,3mMMgcl2,50mMHepes,1mMDTT,0.5ug/mlLeupeptin,20uMpmsf(PH=7.4)1mMEGTAbufferC:0.5ug/mlLeupeptin,20uMpmsf,50mMTris-cl(PH=7.0),2）分离细胞膜蛋白的方法：1、细胞放在冰上，去除上清，用pH7。4的冷磷酸盐缓冲液洗涤单层细胞两次2、加入1ml2%TritonX溶液冰浴15min3、刮下单层细胞，4度下10000g5min离心4、溶液37度水浴10min以分离水相和去污剂相，然后37度下2000g离心5min5、收集水相留作分析6、用500ul冰冷的bufferC溶解去污剂相沉淀，冰浴2min后加温，在按步骤6再次离心7、按步骤8再次抽提去污剂相，用bufferC将洗涤后的去污剂相稀释到初始体积8、用等量的bufferA分别稀释水相与去污相，并进行免疫沉淀实验试剂：1、2%tritonX114:2%TritonX114、50mmol/LTrisHCl（pH7。5）、蛋白酶抑制剂2、缓冲液A（含0。5mol/LNaCl的RIPAbuffer）3、bufferC10mmol/LTrisHCl(pH7.5)150mmol/LNaCl5mmol/LEDTA(PH7.5)3）分离细胞膜蛋白的方法：7Murea2Mthiourea4%chaps2.5%sb3-101000000个细胞，可用此buffer1ml。冰浴匀浆。冰上置30分钟。4度高速低温离心30min。取上清-20保存。4）分离组织膜蛋白的方法：1、取组织，加入10mlBufferA于冰上充分匀浆。2、J6-HC离心机800rpm，4℃离心10min后，所得上清液转入超速离心管。3、100000g，4℃离心1hr。弃去上清，沉淀用适量的BufferB重悬，冰上孵育2hr后分装至EP管，Eppendorf台式离心机10000rpm，4℃离心30min。4、收集所得上清液即为膜组份。BufferA：0.32M蔗糖，5mMTris-HCl（PH7.5），120mMKCl，1mMEDTA,1mMEDTA,0.2mMPMSF,1ug/mlLeupeptin,1ug/mlPepstatinA,1ug/mlAprotinin。冰上预冷。BufferB：20mMHEPES（PH7.5），10%甘油，2%TritonX-100,1mMEDTA,1mMEDTA,0.2mMPMSF,1ug/mlLeupeptin,1ug/mlPepstatinA,1ug/mlAprotinin。冰上预冷。5）分离组织膜蛋白的方法：RIPA1XPBS1%NP400.5去氧胆酸钠0.1%SDS以下用时加入10mg/mlPMSF异丙醇（终浓度10ul/ml）Aprotinin（30ul/ml）1000mMSodiumOrthovandate（10ul/ml）冰冻组织100mg/细胞1000000个，可用RIPAbuffer1ml。冰浴匀浆。冰上置30分钟。4度高速离心30min，20000转低温离心最佳。取上清-20保存。6）分离细菌膜蛋白的方法：①于20ml营养肉汤中过夜培养细菌，37℃，200rpm。②10000g、20min、4℃离心，去上清。③20ml预冷的Tris-Mg缓冲液重悬，同样条件离心，再重悬于预冷的Tris-Mg缓冲液。④超声波破碎细菌。⑤3000g，10min、室温下离心去除未破碎细菌。小心吸取上清（含有胞质成分和细菌外被成分）。⑥超速离心I：100,000g，60min，4℃，去除上清（胞质成分），收集细菌外被成分。⑦用10ml含2％的SLS的Tris-Mg缓冲液重悬沉淀物，室温温育20-30min。⑧超速离心II：70,000g，60min，室温沉淀收集外膜蛋白，去除上清（含细胞质膜）。重复⑦、⑧两步。⑨充分吸除上清，并根据沉淀体积大小用0.1-0.2ml的ddH2O重悬沉淀物。根据公式：蛋白浓度(mg/ml)=1.450D280-0.740D260测定外膜蛋白浓度，调节蛋白浓度至40ug/ul，该蛋白质样品-70℃贮存。试剂①Tris-Mg缓冲液10mMTris-Cl5mMMgCl2pH7.3，4℃保存②2%(w/v)十二烷基肌氨酸钠(SLS)7）来源于MethodsEnzymology(1974)1.取一定量酶处理的细胞，用匀浆器破碎，操作要温和，使细胞膜保持完整。由于水与膜的疏水部分之间有反应，因此要精确掌握分离介质中的离心强度和渗透压，以每克细胞湿重加40ml介质。2．用Potter-Elvehiem匀浆器，杆与壁间间隙0.5～0.6μm,14.4kr/min上下匀浆4～6次，每次5S。3．过滤匀浆液，150g离心10min，保留上清，沉淀部分加入50μl介质，用匀浆器1kr/min匀浆3次，150g离心10min，沉淀部分再加入上次匀浆的上清液。4．合并3次上清液，2kg离心10min，弃上清，沉淀部分溶于100μl介质，离心10min，弃上清，留沉淀。5．将沉淀部分加入70%蔗糖15份，然后分别置于三个离心管中，上面依次叠加54%、49%、45%，41%，37%蔗糖溶液各2、2、5、5、3份。6．700kg离心90min，分离介质在1.16～1.18之间形成介面。7．收集d为1.16～1.18g/ml之间的细胞膜，加30倍的介质以2.5kg离心10min，洗涤2次。8．保存于2.7mmol/LTris-HClpH7.5缓冲液中，用于细胞膜的研究分析8）常用的制备粗制质膜组分的方法：（所有操作都在4摄氏度下进行）1.在冰冷的匀浆缓冲液中切碎组织块，倒出血水。用匀浆缓冲液漂洗组织碎块，并将它们置于冰上，重复上述操作，直至组织碎成1mm3大小的碎片，且无可见的血。2.加入5倍（体积比）与组织块体积的缓冲液，再置于冰浴的Dounce氏玻璃匀浆器中，抽研10-20次，匀浆组织。3.匀浆4摄氏度600g离心10min，上清含细胞膜、线粒体和细胞溶胶。沉淀中有未破碎的细胞及细胞核。弃沉淀。4.上清4摄氏度8000g离心10min，沉淀线粒体。弃沉淀。5.上清4摄氏度10000g离心20min，弃上清。6.用匀浆缓冲液重悬沉淀，继续匀浆，再次4摄氏度，10000g离心20min，弃上清。7.用小体积的适宜缓冲液重新彻底匀浆沉淀。8.粗制的样品可于干冰/乙醇中速冻，保存于-80摄氏度。9）