ELISA技术的质量控制

ELISA技术的质量控制概述Engvall和Perlmann于1971年首先建立了酶联免疫吸附试验（enzymelinkedimmunosorbentassay,ELISA）。随着科技的发展，ELISA在抗原、抗体、酶、固相载体及包被技术等方面都有较大的进步，其灵敏度和特异性均大大提高。由于该技术具有简便、快速、经济等特点，因而已被广泛应用于各行业。尽管如此，ELISA在应用过程中仍然存在着许多难点，必须严格控制才能保证检测的质量。ELISA质量保证是一个复杂的过程，许多重要的环节都影响到检测的质量。现分述如下：一、方法学的影响ELISA测定模式包括以下几种：双抗体夹心法、间接法、双抗原夹心法、IgM抗体捕捉法、竞争抑制法，其中竞争抑制法因受操作时差所引起的不公平竞争等因素的影响，结果重复性较差，质量较难控制。二、试剂因素1.试剂的选择免疫检测的原理均基于抗原抗体反应。由于该反应过程受多种因素的影响，如普遍存在基质效应、交叉反应等，因而检测结果难以溯源，不同方法、不同试剂之间甚至同一试剂不同批号间结果均缺乏可比性。试剂质量在很大程度上决定了检测的水平，因此在引入新项目之前必须对试剂进行严格的评估。试剂的评估有以下几个步骤：⑴确定开展该项目的必要性；⑵了解该项目现有的检测方法和原理；⑶在了解试剂的组成基础上选择多家试剂盒进行比较，判断标准首选参考方法或参考物质，其次为临床的满意度及权威机构的报告如各级室间质量评价、CDC报告等；⑷定期对检测结果进行追踪反馈直至最终认可该试剂。2.试剂的准备不同批次的ELISA试剂在制作过程中很难保证质量完全一致，即使是通过批批检的项目其检测结果也存在差异，因此必须选择和订购长批号的试剂，并保证保存条件。严格执行这一标准可以避免因试剂批号改变而重新建立质控体系及重新评估试剂的复杂过程，并且能够保证结果的稳定性；对于效期短、使用率低的试剂，应当小量分装，每次使用则取分装部分即可，避免反复冻融造成试剂的失效。试剂使用前必须平衡至室温，否则会影响检测下限。未用完的室内质控品及本次不需使用的试剂应密封并及时放回冰箱保存。三、样本因素标本干扰因素包括内源性干扰因素和外源性干扰因素，前者包括类风湿因子、补体、异嗜性抗体、自身抗体、溶菌酶等，后者包括标本溶血、标本被细菌污染、标本贮存时间过长、标本凝固不全、冷冻标本的反复冻融等。其中外源性干扰因素是我们在检测过程中可以避免也是必须避免的因素，而避免内源性因素的干扰则主要通过选择合适的试剂盒。在临床中遇到少见的疑难病例时应当考虑到内源性干扰因素的存在。以下对外源性干扰因素进行简要说明：1.标本溶血要注意避免出现严重溶血。血红蛋白中含有血红素基团，其具有类过氧化物的活性，因此，在以辣根过氧化物酶（horseradishperoxidase,HRP）为标记酶的ELISA测定中，如果血清标本中血红蛋白浓度较高，则其就很容易在温育过程中吸附于固相，从而与后面加入的底物反应显色。2.标本被细菌污染标本的采集及血清分离要注意尽量避免细菌污染。细菌菌体中除可能含有内源酶对测定产生非特异性干扰外，还可能对抗原抗体等蛋白产生分解作用。另外标本在保存中出现浑浊或絮状物时，应离心沉淀后取上清检测。3.标本贮存时间过长标本在低温下保存时间过长，IgG可聚合成多聚体，在间接法ELISA测定中会导致本底加深、甚至出现假阳性结果。通常情况下血清标本可在2～8℃下保存l周，冷冻保存时间会更长，但对于抗体或抗原含量低的标本而言，则可能会因抗体掉价、抗原分解而出现假阴性结果。4.标本凝固不全血液通常在采集后半小时后开始凝固，18～24h完全凝固。如果在血液未凝固时即离心分离血清，则可因纤维蛋白原非特异吸附于微孔而造成假阳性结果。为了缩短标本处理时间，可以在离心前将血液标本置于温箱中温育或者采用带分离胶的采血管或于采血管中加入适当的促凝剂以加速血清的分离。5.冷冻保存标本避免反复冻融标本的反复冻融会因其所产生的机械剪切力对标本中的蛋白等分子产生破坏作用，使抗体效价跌落从而引起假阴性结果，所以测抗体的血清标本如需保存作多次检测，宜少量分装冻存。此外，标本在冻存时会因蛋白质局部浓缩，分布不均，因此重新融解的标本必须混匀，但不要进行剧烈振荡，反复颠倒即可。四、操作因素对ELISA结果的影响ELISA测定一般遵循以下步骤：固相包被→加样品→温育→洗涤→加酶结合物→温育→洗涤→加底物→温育→显色→终止显色→比色目前各种形式的ELISA自动分析仪已经进入市场，如广泛应用于血站系统的微板式全自动酶免分析仪，其试剂为开放式的，而对于其它类型的仪器，则试剂和仪器往往是配套的。但当前大部分医学实验室均采用手工操作加仪器测定的方式。ELISA操作步骤复杂，操作不当将引起较大的误差。以下叙述各个步骤中的影响因素。1.加样加样器是一种比较精密的工具，其在长时间使用时会因机械磨损或者推动杆内附着血痂等原因造成加样不准，尤其是对于样本量较大的临床实验室，因此必须定期对加液器进行维护和校准。每次加不同的标本时均需更换吸嘴，以免发生交叉污染。加样时速度不可太快，避免将标本加在孔壁上部，并注意不要溅出或产生气泡。加样时还应当注意操作时差对结果的影响，操作时差是指加入标本、试剂及混匀时间的差异。操作时差在每个实验中都存在，尤其是手工操作，日常检测标本多达几百个，从加入第一个标本到最后一个标本，需几十分钟，加入试剂及混匀等均存在着前后的时间差异，使抗原抗体反应和酶促反应时间不一致，操作时差对竞争法检测的结果影响更大，在加酶结合物和底物时可用定量多道加液器，使加液过程迅速完成。如果使用滴瓶除注意滴加的角度外还要注意滴加的速度，速度太快，容易出现重复滴加或者加在两孔之间，造成非特异性吸附。另外有些项目在检测前需要稀释以减低非特异性反应，但稀释的方式非常重要，如果采用手工稀释则容易因操作者个体差异而产生不一致的结果，尤其是吸光度处于临界值附近的标本，因此最佳的方式是采用振荡器混匀。2.温育在ELISA检测中一般有两次抗原抗体反应，即加标本和加酶结合物后。抗原抗体反应的完成需要有一定的温度和时间，这一保温过程称为温育(incubation)。温育常采用的温度有43℃、37℃、室温和4℃（冰箱温度）等。37℃是实验室中常用的温育温度，也是大多数抗原抗体结合的最适反应温度。有实验表明，抗原抗体反应一般在37℃经1～2小时产物的生成可达顶峰。为加速反应，可在一定范围内提高反应的温度并在反应过程中连续振荡以增加抗原抗体接触的机会。抗原抗体反应在4℃反应更为彻底，形成的产物更多更稳定，但因所需时间太长，在ELISA检测中一般不予采用。温育的方式有温箱法、微波辐射法、水浴法等，其中水浴法能较好解决因受热不均衡所致的周围孔与中央孔结果的吸光度差异（这种现象被称为“边缘效应”）。若用温箱温育则ELISA板应放在湿盒内，湿盒要选用传热性良好的材料如金属等，在盒底垫湿的纱布，最后将ELISA板放在湿纱布上。采用这种温育方式的关键是必须保证湿盒内的温度达到反应的要求，可在反应前将湿盒预温至规定的温度，并用温度计监测反应过程。采用水浴时，将ELISA板置于水浴箱中，板底贴着水面。为避免蒸发，板上应加盖或用塑料贴封纸或保鲜膜覆盖板孔，此时可让反应板漂浮在水面上。温育过程中，反应板不宜叠放，以保证各板的温度都能迅速平衡。严谨的ELISA试剂盒一般都规定了明确的温育温度，若要求室温温育，则一般是指20～25℃。微波辐射法能缩短温育时间，但不能解决“边缘效应”，因而较少使用。3.洗涤洗涤是ELISA测定过程中决定实验成败的一个关键步骤。其目的是去除反应体系中与反应无关的成分、未结合的酶结合物以及反应过程中非特异性吸附于固相载体的干扰物质。由于抗原和抗体的包被通常是在碱性条件下与固相的疏水键相互作用而被动吸附于其上的，因此必须注意非离子去垢剂的使用浓度，最常用的洗涤液是含0.05％吐温20的0.02mol/L，pH为7.4的PBS液，如果洗涤液中的吐温20超过0.2％，可使包被于固相上的抗原或抗体解吸附而影响实验的测定下限。洗涤可采用洗板机或手工洗涤两种方式，手工洗板则分为浸泡式和流水冲洗式洗涤。无论洗板方式如何，在向板孔内注液时应当避免气泡残留孔内，否则会因洗涤液难以进入孔中而影响洗涤效果。在采用洗板机洗板时，一定要将板条平放于板架上，保证洗板机上的每个吸液针都能一致地插入板孔底部将洗液完全吸净，否则空白值将升高甚至出现“花板”现象（背景不干净），造成实验失败，尤其是当酶结合物非特异吸附而残留于板孔时。若采用手工洗板，则可在每次弃去板孔内液体后将反应板于布料上拍干，布料可在消毒洗涤后重复使用。手工洗板一般为3～5次，使用洗板机洗板时，其所需次数可通过以下实验确定：选择8×12HBsAgELISA包被板条，在每孔中平行加入相同的一份弱阳性血清，按试剂盒说明加入酶结合物并完成温育，洗板机设置如下：第1次洗涤1排、第2次洗涤2排、第3次洗涤3排……直至8次洗涤8排，每次只洗涤1遍，其结果是第1排洗涤了8遍，第2排洗涤7遍……第8排洗涤1遍，加底物显色后，根据吸光度值不再改变的反应条的洗涤次数来确定最佳的洗板次数，例如第3排反应条吸光度值不再改变，则认为该项目最佳洗涤条件为6遍。另外有三方面必须注意：一是在使用洗板机洗板时，通常在上机前应先将反应液弃去并用流水快速冲洗1遍，避免因反应液对洗板机管道污染而造成的交叉污染和背景颜色加深，但对于粘性大的稀释液或反应液而言，则需直接上机洗涤，并增加洗板后清水冲洗管路的次数；二是对于两步法而言第一步洗涤次数不宜太多，否则将降低结果的吸光度值。4.显色显色是ELISA中的最后一步温育反应，在以HRP作为标记酶的ELISA试剂盒中，主要采用TMB和OPD两种底物，其中以TMB最为多见，TMB底物显色一般要求室温或37℃反应15～30分钟。研究表明，显色受时间和温度的影响，一般37℃反应30分钟可使显色充分，如果缩短反应时间或者降低反应温度均可影响检测的下限。为了保证结果的稳定性，必须固定显色时间和温度，但不少操作者往往忽略了这一点。TMB显色体系的A液和B液可在使用前先混合然后用排枪加入反应孔中，这样既节省人力又缩短了操作时差对结果的影响。反应液应新鲜配制并且避免接触金属器皿，否则可因氧化等原因产生颜色反应。OPD由于其具有致癌性目前已很少使用。5.比色ELISA显色的结果必须通过酶标仪进行检测，有两个重要的原因：一是不同的个体的色觉存在差异，如果仅凭肉眼判断，则结果重复性差，并且难以形成统一的判断标准，尤其是对于HBeAb、HBcAb这样的检测项目；二是日益频繁的医疗纠纷要求临床实验室必须对ELISA检测的原始吸光度值，阴阳性判断结果等原始数据进行保存，否则面对医疗纠纷时将无法举证。TMB的终止液有多种，叠氮钠和十二烷基硫酸钠（SDS）等酶抑制剂均可使反应终止，各类酸性终止液则将蓝色转变成黄色。有实验表明，从终止反应后2分钟开始，样本的吸光度值逐渐下降，起始吸光度值越高其下降速度越快，为保证实验结果的稳定性，宜在终止反应后2分钟内读取吸光度值。酶标仪应采用双波长进行测定，必须包括对颜色产物敏感和不敏感的两个吸收峰波长，在非敏感波长处测定特异性显色的吸光度值接近为零，此时测的吸光度值为容器上的划痕、指印、背景等造成的光干扰。以TMB底物为例，其最大吸收的波长为450nm，非敏感波长为630nm，双波长检测最终得到的吸光度值为两者之差。双波长测定能去除背景的干扰，一般不设空白孔，否则会出现吸光度值为负值的现象。酶标仪的使用需强调仪器的维护和保养，酶标仪首先应放置通风处，避免机器内部尤其是滤光片发霉，在使用过程中避免酸等物质溢出腐蚀仪器，每半年或一年请计量局对酶标仪进行检定，并请厂商定期维护。比色前应先用洁净的吸水纸拭干板底附着的液体。酶标仪在使用前应先预热15～30分钟，测读结果会更稳定。五、灰区的设置通常情况下，ELISA定性实验以“阳性”和“阴性”来报告结果，两者间有一条分界线被称为“阳性判断值”（cut-offvalue，CO值）