第七章植物原生质体培养

第七章植物原生质体培养与体细胞杂交PlantProtoplastCultureandSomaticHybridization第一节原生质体的用途•植物原生质体(protoplast)是没有细胞壁的裸露细胞，它在一些研究方面具有独特的优势。1.原生质体是研究细胞骨架、细胞壁的形成、细胞膜的结构、大分子物质进出细胞过程与机理等问题的良好实验体系。2.转基因的良好受体：与外源DNA（如质粒）共培养时，原生质体可以直接吸收外源DNA，并整合到染色体上，从而实现对植物细胞的遗传转化，进一步通过植株再生就可得到转基因植物。GFP质粒浓度对烟草原生质体转基因效率的影响GFP=绿色荧光蛋白PEG介导的甜橙原生质体转GFPPCR分析Sothern杂交分析3.体细胞杂交（somatichybridization）：由于原生质体没有细胞壁，所以不同的原生质体可以相互靠近，发生融合。2种不同植物体细胞发生融合的过程，称为体细胞杂交。所得到的融合细胞为杂种细胞，再通过植株再生就可能创造出新的植物个体。Tomato-potatohybrid第二节原生质体的分离要进行原生质体培养和操作，就必需有大量高质量的原生质体。分离原生质体主要采用酶解法。酶解法：利用酶降解植物细胞壁而获得原生质体。酶解法分离原生质体的效率高，用少量的材料就可以得到大量完整的原生质体，已成为分离原生质体的最主要方法。一、材料的选择用于分离原生质体的植物材料应是细胞分裂旺盛的材料，如幼嫩小苗的根、胚轴、子叶、幼叶等；处于快速生长期的愈伤组织或悬浮细胞。对于容易培养、再生能力强的叶植物（如烟草、菊花、胡萝卜、矮牵牛等）也可用完全展开的叶片作材料。二、酶解处理1.酶解液准备：由于植物细胞壁的主要成分是纤维素、半纤维素和果胶质组成的，所以酶解液中一般应含有纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶，浓度为0.5-2.0%。在配酶解液时可以用原生质体培养基作溶解剂，也可用专门的溶液（CPW溶液）作溶解剂。CPW=Cell-ProtoplastWashMediumKH2PO427.2mg/LKNO3101.0mg/LCaCl2·2H2O148.0mg/LMgSO4·7H2O246.0mg/LKI0.16mg/LCuSO4·5H2O0.025mg/L为了保持释放出来的原生质体的活力和膜稳定性，必须使原生质体处于一个等渗环境中。因此，酶解液中必须加入渗透压调节剂。常用的渗透压调节剂有葡萄糖、甘露醇和山梨醇等，浓度一般为0.35-0.8mol/L。具体用什么浓度，可根据材料的水势来确定。酶解液配制好后，要用过滤灭菌的方法进行灭菌，并且随配随用。2.酶解：将植物材料放入酶解液中、释放出原生质体的过程。叶片、幼茎和根等材料要切成小片；叶片最好撕去下表皮。悬浮细胞要离心后再酶解。材料与酶解液的比例：2-10g/100ml酶解液。一般在25±2℃、黑暗中酶解，期间轻轻摇动几次，或放在50rpm的摇床上。酶解时间因材料而异，2小时~十几小时。苜蓿叶片的酶解法分离原生质体三、原生质体的收集与纯化1.过滤：酶解结束后，将酶解物通过孔径为20-80µm的不锈钢筛网过滤，除去未被酶解的组织块和细胞团。2.离心：滤液转到离心管中在50×g下离心5min。3.反复洗涤：离心结束后，弃去上清液，用培养基和原生质体洗液重新悬浮沉淀的原生质体，再离心。如此反复2-4次，就可以将残留的酶液去掉。4.纯化：用含高浓度（21%）蔗糖的培养基进行离心、纯化，完整的原生质体漂浮在上清液的上部。苜蓿叶片原生质体的纯化完整的原生质体5.收集原生质体：完整的原生质体四、原生质体活力的测定原生质体活力的高低对后来的原生质体培养和融合影响极大。原生质体分离过程中的任何一个步骤都会影响到原生质体的活力，因此，必须十分小心。测定原生质体活力的方法常用荧光素双醋酸酯（FDA）染色法。原生质体活力（%）=发荧光的原生质体数/原生质体总数×100FDAFDA荧光素酶水解紫外光荧光素完整、有活力的原生质体细胞核荧光素双醋酸酯第三节原生质体培养原生质体制备好后，用培养基将原生质体调至一定的密度（最低起始细胞密度以上），及时地进行培养。在适宜的培养条件下，原生质体数小时后开始形成新的细胞壁，在显微镜下可见原生质体由圆球形逐渐变为方形、多边形等。约24-36h后，原生质体开始发生第一次分裂；以后随着细胞分裂，原生质体就形成细胞团，进一步诱导出植株。苜蓿原生质体分裂6weeks8weeks苜蓿原生质体形成细胞团苜蓿原生质体再生植株转GFP基因的苜蓿原生质体再生植株夜来香原生质体植株再生1天5天7天10天4周5周7周单倍体烟草原生质体培养与植株再生杨树原生质体培养植株再生7000,000cells/gfreshleaves25000cells/ml;NH4NO3-freeMS+5M2,4-D+0.05TDZM.PE:34.7%atday14杨树原生质体培养植株再生LiquidMS+5M2,4-D;MS+10MKTor1MTDZ.杨树原生质体培养植株再生1/2MS将含原生质体的培养液倒入培养皿底部，使其成一薄层，封口后进行培养。•1.液体浅层培养原生质体的培养方法含原生质体的液体培养基特点：操作简单，对原生质体的损伤小；容易添加新鲜培养基和转移培养物；原生质体分布不均匀，易发生原生质体之间粘连；原生质体的位置不能固定，所以不能跟踪观察单个原生质体的生长过程。2.固体培养（平板培养）35℃左右的琼脂或琼脂糖培养基与原生质体溶液混合，摇匀，倒入培养皿中，琼脂或琼脂糖凝固后，就成一薄层。进行平板培养时，要注意混合时培养基的温度。温度高对原生质体的伤害大；温度低，培养基凝固，原生质体与培养基不能混匀。特点：原生质体被固定，易观察、统计原生质体的分裂情况；添加新鲜培养基和转移培养物比较麻烦。含原生质体的固体培养基（1）液体浅层—固体平板培养双层培养法：培养皿底部铺一层琼脂或琼脂糖培养基，再将原生质体悬浮液倒入或滴入固体培养基表面。优点是固体培养基中的营养可以缓慢释放倒液体培养基中。如果在固体培养基中加入活性炭，还可以吸附培养物分泌的有毒物质，促进原生质体的生长和分裂。3.液体—固体结合培养固体培养基含原生质体的液体培养基（2）琼脂糖珠培养：用移液管吸取含原生质体的琼脂糖培养基，滴在培养皿或三角瓶中，待其凝固后，再加入适量的液体培养基，进行旋转培养。也可以等含原生质体的琼脂糖培养基凝固后，用刀将其切成小块，再放入液体培养基中培养。改进了培养物的通气和营养环境，从而促进可以促进原生质体的分裂及细胞团的形成。含原生质体的琼脂糖珠液体培养基在培养过程中，原生质体分裂开始以后，培养基中的甘露醇或山梨醇的浓度要逐渐降低，否则会影响细胞的继续生长、分裂。待原生质体形成的细胞团（愈伤组织）达到1mm时，应将细胞团转移到新鲜的培养基上继续培养。所形成的愈伤组织就可以按照普通的愈伤组织进行培养和植株再生。三、影响原生质体培养效果的因素原生质体培养效果的好坏，也可以用植板率来衡量。1.植物材料：用于分离原生质体的植物材料对原生质体后来培养的效果影响极大。不同的植物、同一植物不同的品种，其遗传组成存在差异，原生质体的培养效果也就必然有差异。如Yamada曾用26个水稻品种的种子诱导出愈伤组织，再建立悬浮细胞培养，以悬浮细胞分离原生质体，结果只有1个品种的原生质体再生了植株。一般来说，容易培养的植物、外植体，其原生质体也容易培养，反之，亦然。草本比木本容易，幼嫩的材料比成熟的材料容易。2.培养基（1）基本培养基：不同植物原生质体要求有不同的基本培养基。使用什么基本培养基，可以参照相应培养愈伤组织或细胞的培养基。一般认为，原生质体培养基种的大量元素应比愈伤组织培养基中的大量元素浓度低。由于Ca2+影响到膜的稳定性，因此较高Ca2+浓度的对原生质体分裂有利。（2）有机成分：同培养细胞、愈伤组织相比，培养原生质体时要求培养基有更丰富的有机成分，如氨基酸、维生素、CW，YE，LH，CH、小牛血清等。大量的结果表明，培养基中添加谷氨酰胺有利于原生质体的分裂。（3）激素：培养基中要加入一定浓度的细胞分裂素和生长素。由于2,4-D促进细胞分裂能力很强，所以培养基中大都要加2,4-D。（4）条件化培养基：使用条件化培养基可以大大促进原生质体的分裂和细胞团的形成。（5）培养基中的渗透压：原生质体无细胞壁，所以培养基中必须使用渗透压调节剂（甘露醇、山梨醇等），以维持原生质体的稳定。但渗透压调节剂浓度较高往往会抑制细胞分裂和后来的细胞生长。因此，培养基中渗透压调节剂的浓度不能太高，并且在后来的培养过程中要逐渐降低甘露醇或山梨醇的浓度，以利于细胞的持续分裂和生长。第三节体细胞杂交(somatichybridization)由于没有细胞壁的限制，原生质体可以彼此靠近，通过膜的融合而融为一体。如果两个相同的原生质体发生融合，则可以实现染色体加倍。Protoplastfusion期盼的马铃薯与番茄杂种植株如果两个不同植物的原生质体融合，则就可以形成一个新的杂种细胞，此杂种细胞通过植株再生，则可以得到杂种植株。两个不同植物体细胞发生融合的过程，称为体细胞杂交。体细胞杂交克服了有性杂交时生殖隔离的限制，为创造种间杂种、属间杂种，甚至科间杂种创造了条件。体细胞杂交包括4个过程：原生质体的分离；原生质体的融合；杂种细胞的选择和植株再生；杂种植株的鉴定。一、原生质体的分离二、原生质体的融合原生质体融合的过程完全是一个机械过程，所有植物的原生质体都可以发生融合。有些植物的原生质体可以自发融合，但大多数植物的原生质体需要在诱导剂的诱导下才能发生。诱导原生质体的方法有化学法和物理法2种。（一）化学诱导法化学诱导法是利用一些化学物质，如NaNO3、聚乙二醇（polyethyleneglycol,PEG）、高钙高pH等。原理：消除原生质体表面的电荷，促进原生质体彼此靠近、接触，并能促进接触处的细胞膜发生融解，从而实现原生质体融合的。最常用的是聚乙二醇法和高钙高pH法。(1)聚乙二醇法（PEG）聚乙二醇（PEG）是高分子的有机化合物。用于诱导原生质体融合PEG的分子量为6000。PEG诱导融合剂一般用0.01mol·L-1CaCl2·2H2O溶液配制，PEG浓度为30%-50%，蔗糖浓度为4%，可以用高温高压法灭菌，可以在4℃下保存。(２)高钙高pH法高钙高pH法的诱导剂为：0.05M甘氨酸-NaOH缓冲液1.1%CaCl2·6H2O9%甘露醇pH10.4（过滤消毒，随用随配）主要步骤：（1）在离心管中分别将2种植物的原生质体密度调至5-8×105个/ml，然后等体积混合。（2）向原生质体混合液中加入等体积的诱导融合剂，轻轻摇匀后，放置10min。高钙高pH法诱导融合时要保温（30-37℃）。（3）离心（100×g，10min），弃去上清液，用培养基悬浮原生质体。（４）重复（３）２－４次，最后用培养基调至适当的密度。（５）培养（液体浅层培养、平板培养等）对称体细胞杂交:2个原生质体的细胞质和细胞核完全融合形成一个杂种细胞。不对称杂交：一个原生质体的细胞质完全丢失，另外一个原生质体的细胞核完全丢失，再融合形成一个杂种细胞。用X射线、γ射线、碘乙酸、碘乙酰胺处理一个原生质体，使其核失活；用罗丹明（R-6-G，一种亲脂染料，能够抑制线粒体的氧化磷酸化过程）使另外一个原生质体的细胞质失活。原生质体A原生质体B混合诱导剂混合，10min反复洗涤调节密度，培养，植株再生杂种植株选择与鉴定射线、化学物质处理射线、化学物质处理化学诱导原生质体融合方法试剂便宜，成本低。但操作烦琐，而且化学物质的处理往往会影响原生质体的活力，特别是不纯净的PEG。对原生质体活力的影响与化学物质浓度、时间有关。（二）物理方法（电融合，electrofusion）电融合诱导原生质体融合是在电融合仪上进行的。通过高频（500KHz-2MHz）电场脉冲处理原生质体，可以使接触处的原生质体发生膜穿孔，最终导致原生质体融合。这种方法操作比较简单，无复杂的原生质体洗涤过程，对原生质体的副作用比较