扫描电镜制样经验分享---生物样品

扫描电镜制样经验分享---生物样品发布者：飞纳电镜扫描电镜对于样品具有一定的要求：1.样品要尽可能干燥，若样品中含有水份，水分挥发会造成仓内真空度急剧下降，导致图像漂移，有白色条纹，甚至会影响灯丝寿命；2.热稳定性好，热稳定性差的样品往往在电子束的轰击下分解，释放气体和其他物质，污染电镜；3.导电性好，导电性差的样品会发生荷电效应，造成图像畸变，亮点亮线，像散等；4.不含强磁性，强磁性的样品观察一般会出现严重的像散，无法消去，磁性粉末如果粘的不牢固还可能会吸附到探头上，损害电镜。生物样品具有含水量高、质地柔软、导电性差、容易变形等特点，因此采用扫描电镜观察生物样品时，必须对样品进行必要的处理。生物样品通常指的是动物的体液、肌肉、毛发和一些组织器官，植物的根、茎、叶、果实等，以及各类微生物（细菌、真菌等）。生物样品的含水量高，一般为70%-80%，只有少数的样品，如一些花粉、毛发等可以直接放入扫描电镜中观察，大部分生物样品需要经过脱水干燥处理后才能进行观察。生物样品制备的关键步骤是干燥，应尽量减少因水分蒸发导致的形变。大多数动植物，特别是柔软的细胞和组织，在干燥时由于体积应力和表面张力的作用，容易发生明显的塌陷和变形，造成形貌失真。肖媛等人通过查阅大量的文献，比较了各类干燥方法在扫描电镜生物制样过程中的优缺点，归纳总结了微生物、植物和动物样品干燥方法的一般性选择原则，如下表所示。[1]下面，我们就对目前被公认干燥效果最好的临界点干燥法进行详细介绍。表1：五种常用生物样品干燥方法比较干燥方法基本原理适用生物样品优点缺点临界点干燥法利用了物质的临界状态特性所有生物样品被认为是目前生物学扫描电镜样品制备中最可靠、最理想的干燥方法操作复杂，耗时长;需要专用的临界点干燥器和液体CO2;样品有可能被金属锈、油及其他杂质(混入液态CO2中)污染;干燥后的样品很脆易碎冷冻干燥法利用低温使样品冰冻硬化，然后在高真空中通过升华去除水分所有生物样品避免了气相和液相之间表面张力对样品的损害;可干燥较大量的样品需要专门的冷冻设备或专用试剂;可能有冷冻损伤真空干燥法经有机溶剂脱水置换的样品置于高真空中进行干燥，最常用的是叔丁醇真空干燥法所有生物样品，特别是细菌、细胞等微小样品既有冷冻干燥的优点，又无冷冻损伤，还简化操作;无需专用设备，可借用真空喷镀仪来抽真空;可干燥较大量的样品有些样品的干燥效果略差于临界点干燥法自然干燥法样品中的水分或脱水剂自然挥发干燥外表坚硬的样品，如骨、壳、几丁质覆盖的昆虫、有硬膜的生物体、木材、花粉、种子等简单易行，节省时间，不需专用设备干燥过程中组织可能因脱水而收缩变形;易受温度、湿度变化的影响烘干干燥法用烘箱烘干，一般温度控制在80℃不易变形且耐热的样品，如淀粉粒、孢子粉等不易变形且耐热的样品，如淀粉粒、孢子粉等水分蒸发时可能造成样品变形或微小断裂生物样品制备的基本流程如下：取材：一般使用锋利的刀片将样品切成5mm见方，高度3mm左右，在满足观察条件的前提下，样品小一些更好，一方面临界点干燥仪的样品仓较小，另一方面，小的样品尺寸固定液更容易渗透到样品内部，固定效果更好。取材完成后，先进行清洗（超声清洗3-5min），再迅速地放置到固定液中，放置样品脱水皱缩。固定：临界点干燥法前处理常用的固定剂有戊二醛和四氧化锇。戊二醛是一种五碳醛，一般配制浓度为1-4%，常用浓度为2.5%（PH7.2-7.4）。一般市场上所售卖的戊二醛浓度为25%，使用前需要对其稀释。温度较高或者碱性条件下，戊二醛容易发生聚合失去醛基，降低交联能力，因此，我们一般使用0.1M的磷酸缓冲液作为溶剂稀释戊二醛，并在4°C下保存。特别注意，戊二醛对皮肤有硬化作用，皮肤粘上会变黄，难以洗掉，所以使用时一定要带手套。它的反应速度快，是优良的前固定剂。用戊二醛前固定的样品不易变脆，可以进行长时间固定（但最好不要超过一个星期），因而适用于远离实验室或野外现场取材。但戊二醛对于含脂类较多的样品固定效果不佳，如细胞膜。四氧化锇是一种很强的氧化剂，一般配制浓度为0.5-2.0%，常用浓度为0.5-1.0%（PH7.2-7.4）。它具有很强的毒性，四氧化锇气体对呼吸系统有刺激，对眼睛有严重的破坏作用，因此在使用时应特别小心，尽可能在通风橱中进行，并且严格控制用量。但它作为固定剂拥有一些独特的优点：1.四氧化锇可以与脂类、糖类和蛋白质反应。其对脂类的固定作用可以补充醛类固定剂对脂类固定不足的缺点。2.用四氧化锇固定材料时，被还原的锇能沉积在样品表面上，能增加膜的反差，起到电子染色作用，往往细胞膜结构比较清晰。因此，含脂类物质比较少的生物样品（如植物类），采用戊二醛固定，将采取的样品泡入2.5%的戊二醛溶液中浸泡超过4h即可。对于含脂类物质较多的样品（如细胞膜），我们采用戊二醛和四氧化锇双重固定，先在2.5%的戊二醛溶液中浸泡3h以上，再浸泡在1%的四氧化锇1h。漂洗：用0.1M的磷酸缓冲液（PBS）冲洗4次，每次20min，洗净固定液。脱水：配置浓度分别为30%，50%，70%，90%，100%的酒精，用不同浓度的酒精溶液逐级脱水，从低浓度到高浓度（30%2次，50%2次，70%1次，90%1次，100%两次）浸泡1-2次，每次10min。置换：将脱水后的样品浸泡在醋酸异戊酯溶液中15min左右，醋酸异戊酯的极性较低，临界点干燥时，能够更好地与二氧化碳置换，干燥效果更好。干燥：我们采用二氧化碳临界点干燥仪进行干燥。此方法是根据物质处在临界点时的特殊物理状态设计的一种干燥方法。在临界状态下，液体和气体的密度相等，气液界面完全消失，液体的表面张力系数为零。简单来说就是，通过消除样品表面张力、使得样品在不受表面张力损伤的条件下干燥。经过以上步骤，我们就能得到饱满的不皱缩的生物样品了。接着使用飞纳台式扫描电镜分析样品，下图分别为自然干燥的小鼠气管内绒毛（左图）和临界点干燥的气管内绒毛（右图）。左图的内绒毛已经完全塌陷在一块，主要是由于绒毛在自然脱水过程中受到表面张力的作用而收缩。而右图的绒毛是采用二氧化碳临界点干燥，通过消除样品的表面张力，使得样品在脱水过程能够保持原始形貌。图1自然干燥的气管内壁临界点干燥的气管内壁快来按照本文介绍的经验，制备您的生物样品，用扫描电镜观察吧。参考文献：[1]肖媛,刘伟,汪艳,等.生物样品的扫描电镜制样干燥方法[J].实验室研究与探索,2013,32(5):45-53.