分子生物学第3章-现代分子生物学-生物信息的传递(上)

第三章生物信息的传递（上）——从DNA到RNADNARNA蛋白质复制转录翻译逆转录RNA复制基因作为唯一能够自主复制、永久存在的单位，其生物学功能是以蛋白质的形式表达出来的。DNA序列是遗传信息的贮存者，它通过自主复制得到永存，并通过转录生成信使RNA，翻译生成蛋白质的过程来控制生命现象。DNA的基本功能：以基因的形式荷载遗传信息，是生命遗传的物质基础。DNA序列是遗传信息的贮存者，它通过自主复制得到永存（DNA复制）。作为基因复制和转录的模板，是个体生命活动的信息基础。DNA的生物学功能是以蛋白质的形式表达出来的。通过转录生成信使RNA，翻译生成蛋白质的过程来控制生物个体性状（基因表达）。基因表达包括转录（transcription）和翻译（translation）两个阶段。转录是指拷贝出一条与DNA链序列完全相同（除了T→U之外）的RNA单链的过程，是基因表达的核心步骤。翻译是指以新生的mRNA为模板，把核苷酸三联遗传密码子翻译成氨基酸序列、合成多肽链的过程，是基因表达的最终目的。TCATGATTAAGTACTAATDNA的平面结构图细胞核中AGTACTAATDNA的一条链G游离的核糖核苷酸(原料）DNA解旋，以一条链为模板合成RNA细胞核中AGTACTAATGDNA与RNA的碱基互补配对：A——U；T——A；C——G；G—CRNA聚合酶细胞核中AGTACTAATGUU组成RNA的核糖核苷酸一个个连接起来细胞核中AGTACTAATGUUA细胞核中AGTACTAATGGUUA细胞核中AGTACTAATGGUUAA细胞核中AGTACTAATGGUUAAU细胞核中AGTACTAATGGUUAAUA细胞核中AGTACTAATGGUUAAUAU细胞核中AGTACTAATGGUUAAUAUC细胞核中AGTACTAATGGUUAAUAUCDNA上的遗传信息就传递到mRNA上mRNADNA细胞核中DNA分子中的核苷酸排列顺序不但决定了胞内所有RNA及蛋白质的基本结构，还通过蛋白质（酶）的功能间接控制了细胞内全部有效成份的生产、运转和功能发挥。与mRNA序列相同的那条DNA链是编码链（codingstrand）或称有意义连（sensestrand），另一条根据碱基互补原则指导mRNA合成的DNA链则被称为模板链（templatestrand）或称反义链（antisensestrand）。图3-1DNA模板与mRNA分子及多肽链之间存在共线性关系DNA和RNA虽然很相似，只有T或U及核糖的第二位碳原子上有所不同，但它们的生物学活性却很不同。RNA主要以单链形式存在于生物体内，其高级结构很复杂，它们既担负着贮藏及转移遗传信息的功能，又能作为核酶直接在细胞内发挥代谢功能。因为只有mRNA所携带的遗传信息才被用来指导蛋白质生物合成，所以人们一般用U、C、A、G这4种核苷酸而不是T、C、A、G的组合来表示遗传性状。生物体内拥有三类RNA，即：1.编码特定蛋白质序列的mRNA；2.能特异性解读mRNA中的遗传信息并将其转化成相应氨基酸后加入多肽链中的tRNA；3.直接参与核糖体中蛋白质合成的rRNA。3.1RNA的分类3.2RNA的转录3.2.1转录的基本过程无论是原核还是真核细胞，转录的基本过程都包括：模板识别转录起始通过启动子转录的延伸和终止图3-2大肠杆菌中依赖于DNA的RNA转录过程图示转录泡中单链DNA的长度约在17bp左右，被聚合酶复合物所保护的DNA序列约为35bp左右。模板识别阶段主要指RNA聚合酶与启动子DNA双链相互作用并与之相结合的过程。启动子（promoter）是基因转录所必须的一段DNA序列，是基因表达调控的上游顺式作用原件之一。能被RNA聚合酶识别、结合并启动基因转录的一段DNA序列。1.模板识别转录起始前，启动子附近的DNA双链分开形成转录泡以促使底物核糖核苷酸与模板DNA的碱基配对。转录起始就是RNA链上第一个核苷酸键的产生。转录起始后直到形成9个核苷酸短链是通过启动子阶段，此时RNA聚合酶一直处于启动子区，新生的RNA链与DNA模板链的结合不够牢固，很容易从DNA链上掉下来并导致转录重新开始。2.转录起始一旦RNA聚合酶成功地合成9个以上核苷酸并离开启动子区，转录就进入正常的延伸阶段。所以，通过启动子的时间代表一个启动子的强弱。一般说来，通过启动子的时间越短，该基因转录起始的频率也越高。当RNA链伸长到8-9个核酸后，δ亚基解离，起始完成，进入RNA的延伸阶段。RNA聚合酶离开启动子，沿DNA链移动并使新生RNA链不断伸长的过程就是转录的延伸。大肠杆菌RNA聚合酶的活性一般为每秒50-90个核苷酸。随着RNA聚合酶的移动，DNA双螺旋持续解开，暴露出新的单链DNA模板，新生RNA链的3’末端不断延伸，在解链区形成RNA-DNA杂合物。2.转录延伸37℃时，转录生成mRNA的速度大约是每分钟2500个核苷酸，即每秒钟合成14个密码子，而蛋白质合成的速度大约是每秒钟15个氨基酸。正常情况下，从一个基因开始表达到细胞中出现其mRNA的间隔约为2.5分钟，而再过半分钟就能在细胞内测到相应的蛋白质。3转录终止RNA聚合酶启始基因转录后，就沿模板5’→3’方向不停地移动，合成RNA链直到碰上终止信号时才与模板DNA相脱离并释放新生RNA链。所有参与形成RNA-DNA杂合体的氢键都被破坏，模板DNA链与有意义链重新组合成DNA双链。转录的终止：转录到终止位点，不再形成磷酸二酯键，RNA-DNA杂合链分开，DNA双链形成，聚合酶及RNA单链释放。3.1不依赖于ρ因子的终止①终止位点上游一般有一个富含GC碱基的二重对称区，由这段DNA转录产生的RNA容易形成发卡式结构。②在终止位点前面有一段由4-8个A组成的序列，所以转录产物的3’端为寡聚U，这种结构特征的存在决定了转录的终止。图3-7由基因序列决定的转录终止过程示意图新生RNA中出现发卡式结构会导致RNA聚合酶的暂停，破坏RNA-DNA杂合链5’端的正常结构。寡聚U的存在使杂合链的3’端部分出现不稳定的rU•dA区域，两者共同作用使RNA从三元复合物中解离出来(图3-7)。终止效率与二重对称序列和寡聚U的长短有关，随着发卡式结构（至少6bp）和寡聚U序列（至少4个U）长度的增加，终止效率逐步提高。3.2依赖于ρ因子的终止提纯的RNA聚合酶并不能识别特异性的转录终止信号，而加入大肠杆菌ρ因子后该聚合酶就能在DNA模板上准确地终止转录。ρ因子是一个相对分子质量为2.0×105的六聚体蛋白，具有NTP酶和解螺旋酶的活性，它通过催化NTP的水解促使新生RNA链从三元转录复合物中解离。RNA合成起始以后，ρ因子即附着在新生的RNA链上，靠ATP水解产生的能量，沿着5’→3’方向朝RNA聚合酶移动，到达RNA的3’-OH端后取代了暂停在终止位点上的RNA聚合酶，使之从模板DNA上释放mRNA，完成转录过程。依赖于ρ因子的终止3.3转录机器的主要成分1.RNA聚合酶RNA聚合酶是转录过程中最关键的酶，主要以双链DNA为模板，以4种核苷三磷酸作为活性前体，并以Mg2+/Mn2+为辅助因子，催化RNA链的起始、延伸和终止，它不需要任何引物，催化生成的产物是与DNA模板链相互补的RNA。RNA或RNA-DNA双链杂合体不能作为模板。原核和真核生物的RNA聚合酶虽然都能催化RNA的合成，但在其分子组成、种类和生化特性上各有特色。大多数原核生物RNA聚合酶的组成是相同的，大肠杆菌RNA聚合酶由2个α亚基、一个β亚基、一个β’亚基和一个ω亚基组成，称为核心酶。加上一个σ亚基后则成为聚合酶全酶（holoenzyme），相对分子质量为4.65×105。1.原核生物（大肠杆菌）的RNA聚合酶图3-3大肠杆菌RNA聚合酶的主要成分与功能分析表3-1大肠杆菌RNA聚合酶的组成分析亚基基因相对分子量亚基数组分功能αrpoA3.65×1042核心酶核心酶组装，启动子识别。βrpoB1.51×1051核心酶β和β’共同形成RNA合成的活性中心。β’rpoC1.55×1051核心酶？11×1041核心酶未知σrpoD7.0×1041σ因子存在多种σ因子，用于识别不同的启动子ωα亚基可能与核心酶的组装及启动子识别有关，并参与RNA聚合酶和部分调节因子的相互作用。T4噬菌体感染大肠杆菌后对α亚基的一个精氨酸残基进行ADP糖基化修饰，造成RNA聚合酶全酶对启动子亲和力降低。由β和β’亚基组成了聚合酶的催化中心，它们在序列上与真核生物RNA聚合酶的两个大亚基有同源性。β亚基能与模板DNA、新生RNA链及核苷酸底物相结合。σ因子的作用是负责模板链的选择和转录的起始，它是酶的别构效应物，使酶专一性识别模板上的启动子。核心酶在T7噬菌体DNA上约有1300个结合位点，平均结合常数为2×1011。σ因子可以极大地提高RNA聚合酶对启动子区DNA序列的亲和力，酶底结合常数提高103倍，酶底复合物的半衰期可达数小时甚至数十小时。σ因子还能使RNA聚合酶与模板DNA上非特异性位点的结合常数降低104倍，使非特异性位点酶底复合物的半衰期小于1秒。表3-3大肠杆菌中的σ因子能识别并与启动子区的特异性序列相结合因子基因功能-35区间隔（bp）-10区σ70σ32rpoDrpoH广泛热休克TTGACATCTCNCCCTTGAA16-1813-15TATAATCCCCATNTAσ54rpoN氮代谢CTGGNA6TTGCA枯草杆菌中有6种不同相对分子质量的σ因子，其中σ55是主要存在形式，出现在营养细胞中，σ29则主要出现在胞子形成阶段，参与胞子形成期基因转录的调控。在大肠杆菌中，最常见的调控因子是由rpoD基因所编码的σ70。由rpoH编码的σ32是与热休克启动子所控制的基因转录密切相关。由rpoN编码的σ54则参与细胞的氮代谢。由T4噬菌体所编码的σ55能与大肠杆菌RNA聚合酶的核心酶结合，启动T4晚期基因的转录。RNA聚合酶（RNApol）执行多种功能：(1)识别DNA双链上的启动子；(2)使DNA变性，在启动子处解旋成单链；(3)通过阅读启动子序列，RNApol确定它自己的转录方向和模板链。(4)起始，延伸RNA链，最后当它达到终止子时，通过识别终止序列停止转录。真核生物中有3类RNA聚合酶，其结构比大肠杆菌RNA聚合酶复杂，它们在细胞核中的位置不同，负责转录的基因不同，对α-鹅膏覃碱的敏感性也不同。真核生物RNA聚合酶一般有8-14个亚基所组成，相对分子质量超过5×105。1.真核生物的RNA聚合酶表3-3真核细胞中三类RNA聚合酶特性比较酶细胞内定位转录产物相对活性对α-鹅膏覃碱的敏感程度RNA聚合酶IRNA聚合酶IIRNA聚合酶III核仁核质核质rRNAhnRNAtRNA50%-70%20%-40%约10%不敏感敏感存在物种特异性真核生物的RNA聚合酶一般由8-16个亚基组成，相对分子量超过5×105。共同点:(1)聚合酶中有两个相对分子质量超过1×105的大亚基;(2)同种生物三类聚合酶有“共享”小亚基的倾向，几个小亚基(如RPB6、RPC5)是其中3类或2类聚合酶所共有的。除了细胞核RNA聚合酶外，真核生物线粒体和叶绿体中存在不同的RNA聚合酶。线粒体RNA聚合酶：一条多肽链，小，小于7×104，不受α-鹅膏蕈碱抑制；叶绿体RNA聚合酶：多亚基，部分亚基由叶绿体基因编码，较大，不受α-鹅膏蕈碱抑制。3.4启动子与转录起始大肠杆菌RNA聚合酶与启动子的相互作用主要包括启动子区的识别、酶与启动子的结合及σ因子的结合与解离。启动子是一段位于结构基因5’端上游区的DNA序列，能活化RNA聚合酶，使之与模板DNA准确地相结合并具有转录起始的特异性。3.2.1启动子区的基本结构DNA启动子区编码区终止子转录起始+1-10-35RNA转录单元的模式图原核大约20-200bp，真核不同基因差别比较大，一般小于2kb5′3′启动子：基因转录起始所必需的一段DNA序列转录的基本过程模板识别转录起始通过启动子转录延伸转录终止转录的