4生物样品超薄切片技术

生物样品常规制样技术超薄切片技术负染色技术扫描样品制作技术透射电镜特殊制样技术冷冻蚀刻技术电镜细胞化学技术免疫电镜技术X射线微区分析技术第四章透射电镜生物样品制备技术第一节载网和支持膜第二节超薄切片的制作第三节负染色技术第一节载网和支持膜一、载网：用于承载样品的(直径为3mm)网状材料。1.载网的类型及选择：非金属网：载网金属网铜网：惰性网：70％的透过率2.载网的清洗：酸碱法或有机溶剂、蒸馏水等洗净干燥。X射线元素分析常规超薄切片(200目以上)细胞化学二、样品支持膜为了增强样品的强度，在载网表面先覆一层薄膜。1.对膜的要求：本身没有结构，薄而透明，电子束易通过；有足够的机械强度，经得住电子束的轰击；不与样品发生化学反应。厚度在10～15nm2.常用支持膜及其制备福尔莫瓦膜（Formvar):化学名称：聚乙烯醇缩甲醛.特点：机械强度高，制作简便.制作：0.2～0.5％的氯仿溶液，玻璃片汆出,水面剥离法。火棉胶膜：1~2%醋酸戊脂溶液，平皿沉淀法。碳膜：稳定性好，高分辨制样。操作方法0.2~0.5%的氯仿溶液蒸馏水膜1.福尔莫瓦支持膜的制作方法2.火棉胶膜用平皿水面展开法：平皿中盛有双蒸馏水，滴两滴1~3%的火棉胶膜液，待片刻溶剂挥发后，在膜上摆放洁净的铜网，滤纸捞起。3.碳膜制作：用真空喷镀法制膜。第二节超薄切片的制作超薄切片：是指厚度小于100(50~70)纳米的切片。要求：厚薄均匀、厚度符合标准；无皱褶刀痕、震颤和沉淀；细胞结构保存良好，具有良好的电子反差；具有一定程度的机械强度。制作流程：包括六大步，40多次操作取材→固定→脱水→包埋→切片→染色→镜检超薄切片制作流程图0~4℃室温23237~60℃染色观察聚合修块切片捞片取材固定漂洗50%70%80%包埋90%95%100%过渡浸透一、取材从动、植物机体上或细胞及微生物培养物中获取所需要的研究材料的操作过程。1.取材的原则要求：准、快、小、冷、轻五字原则。•准确：根据研究目的确定取材部位，取到典型部位。•快速：材料离体后应在1分钟内投入固定液。•体积小：固定液渗透力所限，样品体积为1mm³或1×3mm长条。•低温：固定液及器材需预冷(0~4℃)，以降低自溶酶的活性。•防损伤：器械要锋利，切割轻巧，防挤压、牵拉损伤组织细胞的内部结构。取材↓固定↓脱水↓包埋↓切片↓染色↓镜检2.取材方法：动物材料的获取：急性处死或麻醉后，在1～2分钟解剖出所需材料，切成标准块立即投入固定液，低温(0～4℃)保存；特殊难取的材料必须原位固定或灌流固定，再取材投入固定液。植物材料的获取：注意部位和方向性。叶片切取1×3㎜长条；根、茎切取标准块；表面有毛刺的材料先用酶处理使之软化，表面有蜡质的叶片先脱蜡，蒸馏水洗净后再取材固定。悬浮样品的获取：加入适量固定液悬浮固定后，低速离心收集成团块再固定。需抽气使样品沉底保低温野外取材：携带冰壶保存固定液和材料，确保动物材料的现场固定；植物材料可保湿带回实验室再取材固定。取材↓固定↓脱水↓包埋↓切片↓染色↓镜检二、固定用化学或物理的方法迅速杀死细胞的过程1.固定的目的：在分子水平上真实地保存组织细胞生活状态的细节，尽量减少细胞的死后变化。2.固定的类型：固定物理固定法：化学固定法：3.固定液的作用：•迅速均匀渗透到细胞内部，稳定各种细胞成分；•破坏细胞的酶系统，阻止细胞的自溶；•通过化学作用建立分子交联，形成细胞骨架；•提供一定的电子反差。超低温快速冷冻固定法使用化学试剂快速杀死细胞取材↓固定↓脱水↓包埋↓切片↓染色↓镜检1~2.0%4.常用固定剂及其特点醛类：甲醛、戊二醛、多聚甲醛和丙烯醛戊二醛：穿透力强，能很好固定蛋白质和糖元、保存核酸、核蛋白，对微管、内质网等细胞膜系统保存较好；不能保存脂类物质，无电子染色作用。配制方法：常用0.1M的磷酸盐缓冲液(pH6.8~7.2)配成2.0～5.0％。选用：单细胞微生物动物组织植物组织厚壁组织浓度高5.0%锇酸(OsO4)是唯一能保存脂肪的固定剂，具有电子染色作用。能固定脂蛋白、核蛋白，不能保存核酸和糖类。取材↓固定↓脱水↓包埋↓切片↓染色↓镜检5.固定方法：(1)单固定法：用于易于渗透的材料和酶的细胞化学(2)双固定法：戊二醛—锇酸双重固定(3)原位固定法：用于难解剖的、对缺氧敏感的组织器官，在保持血液供应的状态，边解剖边滴加固定液，待组织适度硬化后再取材作常规固定。(4)灌流固定：常用醛类固定：用于脑组织、植物叶片的气孔状态等通过血液循环的途径，将固定液灌注到相应部位，待组织适度硬化后再解剖取材，作常规固定。用于解剖关系复杂的组织（神经组织、脑垂体）戊二醛取材↓固定↓脱水↓包埋↓切片↓染色↓镜检直接影响被固定细胞的原有特定形态6.影响固定效果的因素(1)固定液的酸碱度：固定液的酸碱度必须与被固定材料的酸碱度基本一致。例如多数动物的pH值平均为7.4，所以常用PH7.2~7.4；植物体的pH值为6.8~7.1，所以常用PH7.0~7.2；原生动物及胚胎适于pH为8.0~8.5，胃黏膜pH为8.5效果最佳；(2)固定液的渗透压：固定液与被固定组织之间必须保持渗透平衡。电解质：钾钠钙(0.5%CaCl)可防止膨胀非电解质：蔗糖、葡萄糖膜系统稳定剂取材↓固定↓脱水↓包埋↓切片↓染色↓镜检（3）缓冲液类型磷酸盐缓冲液：仿效细胞外液成分配制，无毒且富有生理功能。适于配各种固定液和材料漂洗液。二钾胂酸盐缓冲液有毒，稳定性好。适用于细胞化学和保存脂肪的样品处理、钙离子定位研究可长期保存取材↓固定↓脱水↓包埋↓切片↓染色↓镜检(4)固定时间、温度及样品块大小时间：因材料而异，单细胞和动物材料较短，植物材料及厚壁组织较长。1～12小时。温度：低温以抑制酶的活性，通常在0~4℃条件固定。样品块大小：受固定液渗透能力影响，小块材料易得到良好固定。取材↓固定↓脱水↓包埋↓切片↓染色↓镜检7.注意事项（1）控制固定温度0~4℃利于抑制酶的活性，减少细胞自溶。（2）掌握固定时间：根据材料类型和特点而定，后固定时间不宜太长，否则易造成碎片。（3）充分漂洗：除去残留固定液。（4）特殊材料的特殊处理：•植物及较疏松的材料：抽气使其沉入固定液中；•厚壁组织：采用低压容器或振荡方式促进渗透；•表面有蜡质的材料：应该先脱蜡后固定。取材↓固定↓脱水↓包埋↓切片↓染色↓镜检三、脱水脱水指用适当的有机溶剂，取代组织细胞中的游离水的过程。1.必要性：水分存在会影响非水溶性包埋剂的渗透，进而影响切片的完整性2.常用脱水剂：醇类(乙醇)和丙酮3.脱水方法：梯度系列脱水法。30%→50%→70%→80%→90%→95%→100%2次4.注意事项：•脱水中断只能在70%，高浓度脱水剂易使组织变脆，成分抽提；•末级脱水剂应先用吸水剂处理，以保证脱水彻底；•高浓度脱水操作要快，以防样品内进入空气或吸水受潮。取材↓固定↓脱水↓包埋↓切片↓染色↓镜检四、浸透与包埋：用包埋剂逐步取代样品中的脱水剂，使细胞内外的所有孔隙都被包埋剂填充，聚合后形成适合机械切割的固体包埋块。1.包埋剂：理想包埋剂的特点：粘稠度低，容易渗透；聚合均匀，不产生体积收缩；耐电子束轰击，高温不变形，不升华；本身无结构，并具有良好的切割性能，切片易染色。常用包埋剂：非水溶性(Epon812)和水溶性包埋剂。包埋剂Epon812或618固化剂DDSA（十二烷基琥珀酸酐）MNA（六甲酸酐）增塑剂DBP（邻苯二甲酸二丁脂）催化剂DMP-30调节塑性而改变切割性能用于618边脱水边包埋取材↓固定↓脱水↓包埋↓切片↓染色↓镜检2.浸透四.浸透与包埋脱水后经环氧丙烷过渡,再逐渐浸入包埋剂。包埋剂:过渡剂比例为1:3→1:1→3:1→纯包埋剂浸透时间：因材料而异1:31:13:1单细胞0.50.5~10.5动物材料11~41~2植物材料11~122~12比例时间材料3.包埋常规包埋：用牙签把材料挑入模具，注入包埋剂，做好标记；定向包埋：样品挑入浅槽，摆好方向、注剂、装标签；注意事项：样品块附近不能存在气泡。4.聚合循序渐进提高温度，促进聚合37℃(12h)→45℃(12h)→60℃(24h)取材↓固定↓脱水↓包埋↓切片↓染色↓镜检五、超薄切片制刀→修块→切片→展片→捞片1.切片刀：钻石刀、玻璃刀1～2mm25/38mm4~6.5mm制作玻璃刀：2.修块：除去样品周边的包埋介质和不感兴趣部位，保留有用信息便于切割，提供尽可能大的有效观察面。要点：上、下边必须平行形状：顶端面为梯形的锥体（金字塔形）取材↓固定↓脱水↓包埋↓切片↓染色↓镜检3.切片△=厚度～热膨胀推进式切片机示意图装刀、加水：特别注意刀高和倾角，液面高度；切片、捞片：切片带用睫毛笔收集，铜网沾取；切片厚度的判断：切片表面的反射光和切片下表面反射光产生的干涉颜色为依据，不同厚度切片呈现不同的颜色。干涉颜色暗灰色灰色银白色金黄色紫色切片厚度40nm以下40~50nm50~70nm70~90nm90nm以上取材↓固定↓脱水↓包埋↓切片↓染色↓镜检六、染色1.染色原理：使用重金属盐类与样品中的某些成分结合或被吸附，以增加电子散射量从而达到提高反差的目的。电子染色2.电子染色剂：具有特异性常用染色剂为铀和铅盐醋酸铀：能提高核酸、蛋白质和结缔组织的反差，对膜系统染色较差。配制：1~3%的50%或70%的乙醇溶液，避光保存。铅盐：对膜系统、糖元、核蛋白、脂类有较好的染色作用。常用硝酸铅和柠檬酸钠水溶液配成柠檬酸铅。易产生沉淀污染样品。配制：硝酸铅1.33g柠檬酸钠1.76g双蒸馏水30mlpH11~12pH4.2用力振荡30min，呈乳状悬液，加入8ml1N的NaOH，溶液透明后加水至50ml取材↓固定↓脱水↓包埋↓切片↓染色↓镜检3.染色方法(1)单染色：只用一种染色液（铀）染色的方法。(2)双染色：铀—铅染色法(3)块染色：铅—铀—铅染色可提高反差石蜡层铀染20~30分钟铅染色15~30分钟水洗30×3次材料固定后、脱水前，整块用50%乙醇醋酸铀饱和溶液，4℃染色2~12小时，常规切片镜检。取材↓固定↓脱水↓包埋↓切片↓染色↓镜检4.示踪性染色多用于免疫电镜技术和(酶)细胞化学技术取材↓固定↓脱水↓包埋↓切片↓染色↓镜检(1)概念：用各种大小的离子、分子等颗粒作为示踪物，显示细胞间的连接部位与方式，研究细胞的通透屏障，测量通透孔道的大小，追踪组织液的生理通路。（2）常用示踪剂：硝酸镧（2nm），辽红（0.76nm），无机胶体金，草酸钙以及酶类，铁蛋白等。(3)染色方法：通常将示踪剂加入进所有的处理液中。1%~2%硝酸镧或0.05%~0.8%辽红与戊二醛固定含相同浓度示踪剂的1%锇酸含示踪剂的缓冲液漂洗常规脱水包埋聚合超薄切片直接镜检硝酸镧标记的葱根尖细胞镧颗粒沉积在细胞间隙免疫电镜技术：将免疫学中抗原-抗体反应的特异性与组织化学形态的可见性，利用电镜的高分辨率和放大能力，在超微结构和分子水平上研究细胞的形态和功能。可以进行细胞内抗体-抗原的定性、定位研究。如：免疫铁蛋白、酶（辣根过氧化酶）、胶体金对铁蛋白抗体、酶标记抗体、胶体金标记抗体的定位电镜细胞化学技术：尽可能保存细胞超微结构的同时，在原位将生物化学的反应在电镜下显示出来，从而将结构与功能的研究结合起来。如：酶在细胞内的定位核酸（DNA、RNA）脂肪、碳水化合物的定位各种无机离子（钙离子）定位等胶体金标记的叶绿体超薄切片制作小结一、制作环节应掌握“六要一防”取材要准确固定要及时漂洗要充分脱水要彻底浸透要完全切片要均匀染色防污染二、不同材料制作特点：•动物组织：取材迅速，固定及时；•植物材料：调节处理时间，确保渗透彻底；•游离细胞：注意收集，以防样品丢失；•孢粉、花粉以及藻类：预包埋收集，完全浸透。三.处理时间脱水过渡浸透聚合包埋切片染色取材前固定漂洗后固定漂洗准确防损伤2~4h3次/15min1~2h8级/15min3~4h2次/15min3级/48h铀染：15~30min铅染：10~15min500~700Å微黄色黑色或深褐色防止污染0~4℃室温第三节负染色技术一负染色及