南方医科大学微生物实验报告

2016年南方医科大学医学微生物学实验报告日期2016年5月22号一、实验目的1、掌握培养基制备的原则和一般方法。2、掌握病原菌的分离与培养方法。3、掌握油镜的正确使用、细菌涂片标本的制备、革兰氏染色法，熟悉细菌基本形态。4、熟悉几种常用的细菌生化反应的名称、原理、方法、结果分析及用途。5、掌握血浆凝固酶试验的原理、方法及用途。6、熟悉药物敏感性试验方法的种类、原理及应用，掌握纸片扩散法。7、掌握玻片凝集试验的原理、方法、结果观察与判断。二、实验器材1、天平、称量纸、干粉培养基、锥形瓶、量筒、15支试管、试管架、试管筐、5ml刻度吸管、平皿、洗耳球、酒精灯2、脓汁标本1支，粪便标本1支；伊红美兰平板2个，营养琼脂平板2个，伊红美蓝平板2个，接种环，酒精灯3、斜面4支、细菌分离培养物（上次实验平板）题目脓汁和粪便标本中病原菌的检测成绩实验者作者：马浩楠3140020007参与者名字：马浩楠丁超王尧鑫桂文茁年级专业2014级医学影像专业指导老师罗军4、斜面培养物4支，营养肉汤4支，生理盐水2支，镜油瓶、拭镜纸1套，吸水纸1本，载玻片4张，染色瓶，染色架5、斜面培养物4支，营养肉汤培养物（菌液）4支，半固体琼脂4支，营养琼脂平板4个，糖发酵管1套，抗菌素纸片1套，眼科镊子2把6、半固体培养物4支，药敏试验培养物4个，微量发酵管培养物1套。三、方法与步骤1、培养基的制备：培养基称量干粉培养基(g)水量(ml)煮沸(次）分装(ml)备注营养琼脂11.43003瓶，500ml瓶，平板营养琼脂2.7703514支×3，中试管，斜面营养肉汤1.3601320支×2，小试管，肉汤半固体琼脂1.7603414支×3，小试管，高层（1）营养琼脂培养基的制备：称量11.4g琼脂，置于三角烧瓶中，加入300ml蒸馏水，分2瓶装，用于倒平板。（2）营养琼脂培养基的制备（用于制作斜面）：称量2.9g琼脂，置于三角烧瓶中，加入75ml蒸馏水，放在电炉上，先后煮沸3次，分15支中试管装，每支试管5ml。（3）肉汤培养基的制备（用于制作液体培养基）：称量1.1g琼脂，置于三角烧瓶中，加入50ml蒸馏水，放在电炉上，煮沸1次，分15支小试管装，每支试管5ml。（4）半固体琼脂培养基的制备：称量1.7g琼脂，置于三角烧瓶中，加入60ml蒸馏水，放在电炉上，先后煮沸3次，分15支中试管装，每支试管4ml。2、细菌的分离培养平板划线分离法甲→脓汁标本→营养琼脂平板(黄色）乙→脓汁标本→营养琼脂平板(黄色）丙一粪便标本一伊红美蓝平板(紫色）丁一粪便标本一伊红美蓝平板(紫色）步骤：①接种环烧灼灭菌。②取标本3～6ul。③平板采光，当看到平板表面象镜面有反光的时候，保持这个角度，划线时就能看清划线痕迹，以便控制划线。④接种环与平板呈30～40度角，在平板表面上方，以曲线的形式，作大幅度来回连续划线，边划边退，线段要划得长而密集，每区划线不少于30条。⑤烧掉接种环上多余的标本。⑥转动平板，通过第一区5～7次，使接种环重新沾上少量细菌，同样的方法划第二区。⑦转动平板，接种环通过第二区1次，划第三区。⑧转动平板，接种环通过第三区1次，划第四区。⑨划第五区。3、细菌的纯培养斜面接种分工甲→普通平板→黄色菌落→1支斜面乙→普通平板→白色菌落→1支斜面丙→EMB平板→紫黑菌落→1支斜面丁→EMB平板→粉红菌落→1支斜面方法：接种环→套住菌落→轻刮取菌→接种环取菌后，伸入斜面底部，自下向上先拉→条细菌接种线→再伸入底部，自下向上，作蜿蜒划线→细菌涂布接种在斜面培养基的表面→斜面正面上2/3作标记：组号、颜色→收集平板-灭菌桶内（平板底部朝下，盖朝上放置）→速送灭菌室→高压蒸汽灭菌→洗刷。4、细菌的形态学检查涂片→干燥→固定→染色(1)涂片→干燥→固定甲→黄色，紫黑。乙→白色，粉红。丙→黄色，紫黑。丁→白色，粉红。方法：涂片：①接种环取盐水3ulX2滴，水滴间距小于2cm;②取菌苔少许（1mm小菌落半个）与盐水混勻，涂成大于lcm2;③涂毕→环移至涂膜中央侧立，待环内菌膜破裂，接种环烧灼灭菌。→干燥→固定：手持载玻片→端，涂膜朝上，两个涂膜快速通过火焰外层3次，时间2〜3秒钟。(2)革兰染色涂片→干燥→固定→结晶紫→初染1分钟→水洗→卢戈碘液→媒染1分钟→水洗→95%乙醇→脱色约20秒钟—7尺洗—稀释品红—复染1分钟—水洗—吸干，镜检。油镜使用方法：10X物镜—看清标本—滴加香柏油—100X油镜—浸泡油中→模糊物象→细调节调焦，观察物像→记录结果→关闭电源→擦镜纸拭去香柏油—擦镜纸沾少许乙醇和乙醚（7:3)混合液擦拭→擦镜纸擦拭油镜。5、液体培养基接种（肉汤接种）甲→金黄色，乙→白色，丙→紫黑，丁→粉红。方法：（1)接种环斜面取菌，在靠近液面的管壁上，上下研磨接种；（2)在管壁上，将接种环内的菌膜拍破。退出接种环，烧灼灭菌；（3)标记：组号，颜色6、细菌的生化试验等（1）细菌的糖发酵实验：①在紫黑色的斜面培养基取适量菌落接种在含有葡萄糖的发酵管中，并做好标记②在紫黑色的斜面培养基取适量菌落接种在含有乳糖的发酵管中，并做好标记③在粉红色的斜面培养基取适量菌落接种在含有葡萄糖的发酵管中，并做好标记④在粉红色的斜面培养基取适量菌落接种在含有乳糖的发酵管中，并做好标记步骤：①用砂轮在糖发酵管液面上方2～3cm处，切割一道切痕。②两手握住发酵管将管子折断。管口烧灼灭菌。③接种针斜面取菌，伸入培养基内，在管壁上，上下研磨接种。退出接种针，烧灼灭菌。④管口朝向相同，放置在平皿内。（2）抗菌素敏感性试验纸片扩散法甲→黄色菌液乙→白色菌液丙→紫黑菌液丁→粉红菌液方法：①先取→环菌液；②沿平板直径拉一条细菌接种线；③再取一环菌液；④旋转平板90度角，拉另一条接种线，使两条细菌接种线呈“十字形”；⑤然后在平板上半部，作连续来回密集划线，每次划二分之一平板；⑥旋转平板90度角，二次密集划线；⑦旋转平板90度角，三次密集划线；⑧旋转平板90度角，四次密集划线；⑨设三点，呈等边三角距离；⑩点距离平板边缘约15mm;⑪作标记：青、先、庆；⑫镊子尖嘴朝下，夹取相应药物纸片的边缘，平贴在已设定的位置上，轻轻按压纸片。（3）血浆凝固酶试验步骤：①取二滴兔血浆置于洁净的玻片上。②分别用接种环取白色和金黄色菌苔(约2～3个菌落的菌量)与血浆研磨混合成直径8～10mm的一层薄菌膜。③立即观察结果。（4）半固体穿刺接种法①用接种针取紫黑色菌落垂直刺入半固体培养基，再按原路返回，并做好标记②用接种针取粉红色菌落垂直刺入半固体培养基，再按原路返回，并做好标记步骤：①接种针斜面取菌，从半固体中心,垂直刺入，到达培养基底部5分之4处，再循原来的路线,退出接种针。②管口、接种针经火焰烧灼灭菌③37℃下培养18~24小时。7、细菌的血清学试验、结果分析玻片凝集试验①取洁净的载玻片一张，将磨面近端设为对照区，滴加生理盐水15ul。远端设为试验区，滴加福氏志贺菌诊断血清15ul，②用接种环分别取粉红色菌苔，约2个小菌落的菌量，研磨于盐水或血清内，混合均匀。③载玻片来回倾侧，让菌液充分混匀，凝集速度更快、结果更清楚。④观察记录结果：菌液凝集者记为阳性，菌液均匀混浊记为阴性。四、结果与讨论（一）实验结果1.洗手前后对比图片分析：洗手图不是很理想，上面同学的洗手后与消毒后与预期的不一致，可能是操作不当引起的。2.细菌的分离培养结果：(1)脓汁标本在普通平板上有黄色、白色两种菌落，菌落的色素是脂溶性的，是细菌本身的颜色。菌落直径2mm左右、圆形、隆起、表面光滑、湿润、边缘整齐、不透明。(2)粪便标本在伊红美蓝平板上，有紫黑色、淡粉红色两种菌落，菌落色素是水溶性的，不是细菌本身的颜色，紫黑色菌落具有金属光泽、大而隆起、不透明的菌落，菌落直径2〜3mm；粉红色菌落淡粉红色，半透明，直径1〜2mm.图片分析：由于同学都是第一次划线，所以划线都不是很好。3.细菌的纯培养：在斜面培养基上得到四种菌体的纯培养标本，从普通平板上挑取的黄色或白色菌落接种的斜面，菌苔的颜色，还是原来菌落的颜色，黄色或白色。从伊红美蓝平板上挑取的紫黑色或粉红色菌落接种的斜面，菌苔已经没有原来菌落的颜色。菌苔灰白色、表面湿润、光滑、前者不透明，后者透明。图片分析：中间两组效果不好，可能来自于采菌过少或者划线操作不当4.细菌的形态学检查:脓汁标本（左边为白色菌苔，右图为金黄色菌苔）粪便标本（左图为粉红菌苔，右图为紫黑色菌苔）镜下观察：用普通平板，从浓汁标本中分离得到黄色、白色两种菌落，这两株细菌，显微镜油镜下均为G+球菌，排列不规则，呈葡萄串状，是典型的葡萄球菌。结合菌落色素，这两株葡萄球菌可能是金黄色葡萄球菌和白色葡萄球菌。用伊红美蓝平板，从粪便标本分离、获得紫黑色和粉红色半透明两种菌落。紫黑色菌落可能是能分解乳糖的非致病菌大肠埃希菌。粉红色菌落是不能分解乳糖的致病菌。显微镜下，均为G-杆菌，散在排列，从形态上不能鉴别是什么细菌。6.细菌的生化试验等:（1）半固体穿刺接种法图片分析：实验效果与预期一致，但是拍摄效果不是很好。四组的半固体培养接种的培养图，由于拍摄效果不好，但是依然可以分辨生长的情况。直线生长的表明无鞭毛。(2)细菌的糖发酵试验糖发酵实验结果图.从下至上分别为：（④粉红→乳糖③粉红→葡萄糖②紫黑→乳糖①紫黑→葡萄糖）编号菌苔糖发酵管反应现象结果描述符号甲紫黑糖发酵管变黄色有气泡分解X糖产酸又产气⊕乙紫黑糖发酵管变黄色有气泡分解X糖产酸又产气⊕丙粉红糖发酵管变黄色无气泡分解X糖产酸不产气+丁粉红④糖发酵管变紫色无气泡分解X糖产酸不产气-+：产酸或阳性⊕：产酸产气-：阴性紫黑细菌微型发酵关内液体变黄，产生气泡，气泡的高度分别为10mm和17mm，说明紫黑色菌苔既分解葡萄糖也分解乳糖，产酸产气；粉红细菌只分解葡萄糖，不产气，不分解乳糖。(3)抗菌素敏感试验结果:4图片分析：.3号同学划线最好，本人4号划线不好，还是没有划好。2号同学效果不好，可能取菌过少。4：浓汁标本中白色菌落3：浓汁标本中金黄色菌落2：粪便标本中粉色菌落1：粪便标本中紫黑色菌落药敏试验结果分析青霉素头孢曲松庆大霉素金黄色+++白色+±+紫黑-++粉红-++-：耐药±：中度敏感+：敏感白色细菌对对青霉素敏感，对头孢曲松中度敏感，对庆大毒素敏感金黄细菌对青霉素敏感，对头孢曲松敏感，对庆大毒素敏感紫黑细菌对青霉素耐药，对头孢曲松敏感，对庆大毒素敏感粉红细菌对青霉素耐药，对头孢曲松敏感，对庆大毒素敏感（4）血浆凝固酶实验结果：金黄色（左）与白色（右）菌苔1、白色菌苔不发生凝块，容易涂抹。呈均匀乳白状态。2、黄色菌苔能产生血浆凝固酶，可使血浆中的纤维蛋白原转变为不溶性纤维蛋白,附着于菌体表面,形成凝块，涂抹不开。说明黄色细菌为致病菌。7.玻片凝集试验：由实验结果图可看到，生理盐水一端（左）不出现凝集，福氏志贺菌诊断血清一端（右）菌液虽然不是很不明显，但是可以看到任有少量絮状沉淀，表明为阳性。说明粉红菌为福氏志贺菌。8.结论：对照对照常见肠道感染细菌主要生化反应特征，血清学分析，说明黄色菌落是金黄色葡萄球菌；白色菌落是白色葡萄球菌；紫黑色菌落是大肠埃希菌；粉红色菌落是福氏志贺菌。(二）实验讨论1.分析：制备好培养基后，首先采用平板划线分离法，从脓汁标本中分离出金黄色和白色两种菌落。显微镜下，这两株细菌均为G+球菌，排列不规则，呈葡萄串状，是典型的葡萄球菌；结合菌落或菌苔颜色，这两株葡萄球菌分别是金黄色葡萄球菌和白色葡萄球菌。通过血浆凝固酶试验鉴别，金黄色葡萄球菌是致病菌。最后通过药敏试验，可见不同的抗生素所形成的抑菌圈不同，其中金黄色葡萄球菌对青霉素最敏感，而紫黑和粉红细菌对青霉素耐药。用伊红美蓝平板，从粪便标本中分离出紫黑色具有金属光泽和粉红色半透明菌落。紫黑色菌落是能分解乳糖的大肠埃希菌。粉红色菌落是不能分解乳糖的致病菌。显微镜下，它们都是G-杆菌，散在排列，从形态上不能鉴别是什么细菌。经糖发酵试验，半固体动力试验，血清学试验结果鉴定，它们分别是大肠埃希菌和福氏志贺菌。2.实验的不足之处：我们的实