葡聚糖凝胶层析脱盐

生化实验六学习凝胶层析的工作原理和操作方法；掌握利用葡聚糖凝胶层析进行蛋白质脱盐的技术。目的原理凝胶层析又称凝胶过滤，分子筛或排阻层析。凝胶过滤的主要装置是填充有层析介质的层析柱。凝胶是一种具有多孔、网状结构的分子筛。利用这种凝胶分子筛对大小、形状不同的分子进行层析分离，称凝胶层析。原理1、层析介质的特点（1）遇水为不溶解的固相；（2）是化学惰性物质；（3）离子基团含量少；（4）颗粒大小和网眼均匀；（5）机械强度较强；（6）具有可选择的多种孔径。原理O目前使用较多的是葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶及其衍生物。葡聚糖凝胶（商品名称Sephadex）是最常用的层析介质。它是由一定平均分子量的葡聚糖和交联剂1-氯-2,3-环氧丙烷（CH2-CH-CH2Cl）交联成的具有三维结构不溶水的高分子化合物。调节葡聚糖和交联剂配比，可以获得网眼大小不同，型号各异的凝胶。原理当葡聚糖分子量越小，交联剂用量越大，则交联度越大，凝胶网眼越小，吸水量越小，G值也越小。G值表示每克干胶吸水量（mL）的十倍。例如SephadexG-25其吸水量应为2.5mL/g干胶。常用的葡聚糖凝胶有多种规格，如G-10、G-15、G-25、G-50、G-75、G-100等。原理2、分离原理当混合样液加到凝胶柱上，随着洗脱剂而通过凝胶柱时，分子大小不同的物质受到不同的阻滞作用。颗粒接近或大于网眼的分子，不能进入凝胶的网眼中，在重力作用下它们随着溶剂在凝胶颗粒之间沿较短流程向下流动，受到的阻滞作用小，移动速度快，先出层析柱（此现象叫作被排阻。被排阻的最小分子量称为该规格凝胶的排阻极限）；颗粒小于网眼的分子可渗入凝胶网眼之中，它们被洗脱时不断地从一个网眼穿到另一个网眼，逐层扩散，阻滞作用大，流程长，移动速度慢，因而后出层析柱。原理···原理原理操作步骤1、层析柱的准备（1）清洗：每组取一支层析柱，用清水冲洗干净。（2）安装与检查：检查出口装置中尼龙绸或烧结滤板是否完好干净。安装层析柱，让其垂直固定于滴定台架上。对准出口处，放一只250mL烧杯。向层析柱内灌洗脱剂，打开出口螺旋夹，检查有无渗漏、出口乳胶管是否通畅等情况。（3）排气泡：保持柱内一定的水位，用手指弹击柱壁，部分气泡会从溶液中上浮排出。出口处的小气泡易停留在螺旋夹附近的乳胶管内，要想法排尽，否则会影响分离结果，排气完毕，保留柱内1～2cm高水位，关紧螺旋夹。（4）标记高度：在距顶端8～10cm处做一标记，作为衡量灌装层析介质床体高度（15～17cm）的依据。操作步骤2、装柱每组用50mL烧杯取溶胀的凝胶悬浆25～30mL，静置片刻，观察凝胶沉淀与水的体积之比，约为1:1即可，否则应作调整。轻轻搅匀杯中凝胶，用玻璃棒引流入柱，打开出水口，并不断地向柱内补充凝胶，直到凝胶沉淀高度位于标记上方约2cm为止，凝胶柱内若有气泡和断层或柱床表面干水和歪斜，都将影响分离效果。必要时，需倒出凝胶，重新装柱。操作步骤3、平衡取15mL洗脱剂，用滴管沿柱内壁旋转着缓缓流下，不可冲动胶平面，打开出水口，经洗脱液的流动，一方面清洗内壁，另一方面使胶床收紧。洗脱平衡完毕，胶床上方保留约4cm高水位，关闭出水口。此时，胶床高度≥15cm为宜。4、准备收集取6只干净的刻度试管（除净试管内残留的水），1～6编号，并在试管2mL处作一标记。操作步骤5、上样与收集打开出口排水，当胶床与上方水层的弯月面相切时，加入0.6mL混合样液。上样完毕，开始收集一号管。每管收集洗脱液2mL。当样液进入胶床，其弯月面与胶平面相切时，暂停排液，用滴管将洗脱剂沿柱内壁旋转着加入1cm高水位，然后排液，至其弯月面与胶平面相切，再缓缓注入3～5cm高的洗脱剂。6、洗脱不断向柱内加洗脱剂，保持胶床上水位3～5cm。出口流速控制在每6秒1滴，直至收集到6号管达2mL。操作步骤7、鉴定另取6只干净试管，按收集顺序将洗脱液一分为二。第一排每管加2滴BaCl2，根据白色沉淀多少，判断SO42-在各管中的浓度。第二排每管加1mL考马斯亮蓝G-250试剂，根据蓝色情况，判断蛋白质在各管中的浓度。将结果记录于下表中。若鉴定的第6号管中，仍有样品，表明洗脱和收集不够，需增加7号、8号……操作步骤管号项目1234567891011白色沉淀量+++蓝色深浅+++8、再生鉴定完毕，打开出水口，继续用２～３倍床体积洗脱剂洗脱，洗脱后关闭出口，以备下次使用。1、根据实验结果，在同一坐标系中，以收集的管号为横坐标，检测物质的量为纵坐标，绘制二条（蛋白质及（NH4）2SO4）洗脱曲线。2、分析混合样品分离效果。结果处理检查胶平面是否水平；加样品及洗脱液时勿冲到胶平面；控制流速；注意事项思考题半透膜透析超滤离子交换色谱等蛋白质脱盐的方法：思考题1、凝胶的选择：视分离混合物的组成而定，是大分子物质与小分子物质分开，即组别分离；还是相对分子质量比较接近的物质进行分离，即分级分离。选择凝胶的另一方面是凝胶的颗粒大小。颗粒小，分辨率高，但流速慢，实验时间长，有时会造成扩散严重；颗粒大，分辨率低。但条件得当，也可以得到满意的结果。影响凝胶分离效果的因素：思考题2、柱子的影响：柱的长短粗细对层析效果都会产生影响。一般柱内径为1cm，如果样品较多，最好用2-3cm。直径太小时会发生“管壁效应”。即柱管中心组分移动较慢，管壁周围移动较快。进行脱盐时，柱高50cm比较合适；分级分离时，100cm就足够了。3、凝胶的装填：要均匀，不能有断路或气泡。4、加样：样品浓度和黏度合适。一般样品所用体积为柱体积的1-4%。影响凝胶分离效果的因素：思考题5、洗脱：洗脱液只要能溶解被洗脱物质并不使其变性就可以了。洗脱速度要恒定且合适。一般来讲，洗脱速度慢，一些样品可以与凝胶基质充分平衡，分离效果好。但洗脱速度过慢会造成样品扩散加剧，区带变宽，切实验时间大大延长。6、分配系数Kav：Kd=（Ve-Vo）/（Vt-Vo）影响凝胶分离效果的因素：相关知识Vt：床的总体积=外水体积+内水体积+颗粒自身体积Ve：洗脱体积Vo：外水体积大分子（大于孔径上限）全部在外水体积中，它在胶床中的洗脱体积等于外水体积。（Kd=0）小分子（小于孔径下限）自由出入网孔，它在胶床中的洗脱体积等于床体积。（Kd=1）Kd=（Ve-Vo）/（Vt-Vo）