乳酸脱氢酶的测定(精)

乳酸脱氢酶的测定概述：乳酸脱氢酶是一种氧化还原酶，其辅酶为NAD＋，为糖酵解的关键酶，广泛分布于人体及动物的各种组织内。人体以肾、心及骨骼最为丰富，其次是肝、脾、胰及肺组织内较多。红细胞中LDH较血清高100倍，溶血标本不宜测定LDH。它以辅酶1为辅酶，催化乳酸和丙酮酸之间的可逆性氧化还原反应。反应的平衡点明显地倾向乳酸的生成，即倾向于丙酮酸的还原，此时的最适PH为7.4-7.8，只需较低浓度的底物，（1.2mmol/L丙酮酸，0.15mmol/L的NADH），即至最适反应浓度，而进行乳酸氧化反应时，最适PH为8.8-9.8，因碱性条件可不断移去反应生成的H＋，以利反应NADH方向进行。并且此时底物浓度需加大至30倍以上，（50mmol/L乳酸，5mmol/LNAD＋）才至最适浓度。LDH只L-A型羟酸有作用，但对D构型的底物无效，LDH由四个亚基组成，M和H两类亚基可聚合成纯四聚体或杂四聚体，形成5种同工酶。LDH受重金属、EDTA和草酸盐的抑制，故EDTA或草酸抗凝血浆也不宜作LDH测定。过量的丙酮酸或乳酸也可抑制LDH，尤对B亚基的抑制更明显。乳酸＋NAD＋――丙酮酸＋NADH＋H＋（正向L-P，逆向P－L）。比色法原理：正向反应生成的丙酮酸与溶于酸的2，4二硝基苯肼作用生成丙酮酸－二硝基苯腙，后者在酸性环境中呈草黄色，在碱性溶液中显棕红色，颜色的深浅与丙酮酸的浓度成正比，与标准浓度的丙酮酸生成的苯腙进行比色，可推算LDH的活力。本法规定37度15分钟产生1umol丙酮酸的酶活力为一个单位，操作步骤：1，校正曲线的制作按表操作加入物(ml)B12345丙酮酸标准液00.0250.050.10.150.2底物缓冲液0.50.4750.450.40.350.3去离子水0.110.110.110.110.110.11二硝基苯肼0.50.50.50.50.50.537度水浴15分钟NaOH5.05.05.05.05.05.0相当于金氏单位01252505007501000室温放置5min后，于440nm波长处比色，比色杯光径为1.0cm，用B管调零，读取各管吸光度。以吸光度值为纵坐标，相应的酶活性单位为横坐标绘制校正曲线。2，酶活性的测定加入物(ml)测定管对照管血清0.010.01NAD＋底物缓冲液0.50.537度水浴5minNAD＋溶液0.1－37度水浴15min2,4二硝基苯肼0.50.5NAD＋溶液－0.137度水浴15分钟0.4mol/L溶液5.05.0混匀，室温放置5min后，于440nm波长处比色，比色杯光径为1.0cm，用蒸馏水调零，读取各管吸光度。以测定管与对照管吸光度之差值查校正曲线，得酶活性。单位定义：以100ml血清，37度，作用底物15min，产生1umol丙酮酸为一个金氏单位。参考范围：190-437金氏单位注意事项：1．乳酸锂、乳酸钾、乳酸钠都可以作为LD的底物，但后两种为水溶液，若保存不当容易产生酮酸类物质从而抑制酶促反应，且含量不够准确，目前少用，而乳酸锂为固体，稳定，易称重。2．除用二乙醇胺缓液外，还可用TRIS或焦磷酸缓冲液。而甘氨酸对LD有抑制作用，故不采用甘氨酸缓冲液。3．标本严禁溶血，也不采用草酸盐，EDTA抗凝血浆。由于LD4，LD5对冷不稳定，不应贮存于冰箱中，血清标本室温可存放2-3天。4．比色应在5-15分钟内完成，否则吸光度值会降低。评价：LD活性测定多采用乳酸生成丙酮酸的反应方向，但反应开始的转化速率是不成线性的，反应速率与温度有关，温度越高，速度越快。以丙酮酸作为底物测定的酶活性所得结果不精确。