基因工程-实验报告

基因工程实验报告学号姓名1实验目的（1）学习并掌握基因工程操作技术中最常用的载体质粒DNA的提取方法。（2）学习琼脂糖凝胶电泳分离DNA的原理和方法，检测质粒DNA的浓度与分子量。（3）了解PCR的基本原理，掌握PCR的基本操作技术。（4）学习利用限制性内切酶切割DNA的方法，并通过电泳检测酶切的效果。（5）学习DNA重组技术中的核心步骤，DNA片段之间的体外连接方法。（6）学习制备感受态细胞并将体外重组DNA引入受体细胞的技术。（7）掌握利用蓝白斑筛选出转化子的方法。2实验原理2.1质粒DNA提取的原理菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时，双链DNA氢键断裂，DNA双螺旋结构遭破坏而发生变性，但由于质粒DNA分子量相对较小，且呈环状超螺旋结构，即使在高碱性pH条件下，两条互补链也不会充分分离，当加入中和缓冲液调时，变性质粒DNA又恢复到原来的构型；而线性的大分子量的细菌染色体DNA则不能复性，与细胞碎片、蛋白质、SDS等形成不溶性复合物。当加入中和溶液后，质粒DNA能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；变形的蛋白质和DNA呈絮状，离心时可以沉淀下来。碱裂法获得的质粒DNA经过苯酚、氯仿抽提，RNA酶消化和乙醇沉淀除去残余的蛋白质和RNA，所得纯化的质粒DNA可满足实验要求。2.2PCR扩增功能基因的原理将反应体系(模板DNA、引物1、引物2、Mg2+、4种dNTP和TaqDNA聚合酶)置于高温(94℃)下变性，使模板双链DNA解链为两条单链。在低温(37~65℃)下退火，使引物与模板链3’端结合，形成部分双链DNA。在中温(~72℃)下，通过TaqDNA聚合酶使引物从5’端向3’端延伸，随着4种dNTP的掺入合成新的DNA互补链，完成第一轮变性、退火和聚合反应循环。反复进行这种变性、退火和聚合反应循环，可使两端引物限定范围内的DNA序列以指数形式扩增。循环的次数主要取决于模板的浓度，从理论上将一个目的DNA分子经20轮扩增后，可达106。2.3琼脂糖凝胶电泳检测DNA含量的原理琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，沸水中溶解，45℃开始形成多孔性刚性滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度。DNA分子在碱性环境中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应。不同DNA，其分子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带。琼脂糖凝胶电泳法分离DNA，主要是利用分子筛效应，迁移速度与分子量的对数值成反比关系。SYBRGold与DNA结合的亲和力高，且结合后能够极大的增强荧光信号。SYBRGold染料的最大激发波长为495nm，在300nm有第二个激发峰，其发射的荧光波长为537nm。2.4DNA的体外连接DNA连接酶催化两个双链DNA片段5’端磷酸和3’端羟基之间形成磷酸二酯键。2.5氯化钙制备感受态和转化大肠杆菌原理把外源DNA分子导入到某一宿主细菌细胞的过程称为转化(transformation)。当细菌处于容易吸收外源DNA的状态即感受态时，转化最易发生。常用的转化方法是用CaCl2处理受体菌，使细菌细胞进入敏感的感受态。当细菌处于冰冻(0℃)的CaCl2溶液中，细菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的DNA形成抗DNase的羧基－钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃短时间热冲击处理，促进细胞吸收外源DNA。2.6蓝白斑筛选重组质粒原理原理lacZ编码β-半乳糖苷酶，受lac启动子调控，当E.coli菌株表达lac阻抑物，则载体上的lacZ基因由IPTG诱导表达，表达形成的酶可以利用X-gal形成蓝色化合物。重组质粒中lacZ插入失活导致不能形成蓝色菌落。3实验试剂及设备3.1实验设备台式离心机、旋涡振荡器、恒温水浴锅、微波炉、电泳仪、电泳槽、凝胶成像检测仪、超净工作台、冰箱、恒温摇床、离心管、移液枪、枪头、冰盒、加样板、量筒100ml、三角瓶500ml、培养皿、锥形瓶150ml、烧杯3.2质粒DNA制备的试剂（1）LB培养基：胰蛋白胨10g，NaCl10g，酵母膏5g，pH7.5，加水1L，高压灭菌。（2）含pBluescriptSK(-)质粒的大肠杆菌。（3）100mg/ml氨苄青霉素水溶液。（4）TE：10mmol/LTris-HCl（pH7.8）—1mmol/LEDTA(pH8.0)。（5）无菌超纯水。（6）溶液II：1%SDS（电泳级）-0.2mol/LNaOH。（7）溶液III：3mol/L醋酸钠溶液（40.8gNaAc.3H2O溶于60mL水中，加入11.5mL冰醋酸，定容至100Ml，高压灭菌，pH4.8。）（8）20mg/mLRNA酶液。（9）水饱和酚。（10）70%乙醇。（11）异丙醇。3.3琼脂糖凝胶电泳的试剂（1）琼脂糖1%（2）加样缓冲液（3）Maker（4）电泳缓冲液（10X）：Tris242g，冰醋酸57.1ml，EDTA.Na2.2H2O37.2g，加水至1L。（5）SYBRGold3.4PRC反应的试剂（1）10XPCR反应缓冲液（2）四种核苷酸混合物(dNTPs)，10mol/L（3）寡核苷酸(PCR引物)（4）模板DNA（5）DNA聚合酶3.5酶切反应及质粒重组的试剂（1）10Xbuffer（2）酶：RcoRI、BamHI（3）ddH2O（4）DNA连接酶3.6感受态的制备、大肠杆菌的转化和重组质粒的筛选的试剂CaCl2、LB培养基、LB培养基-Amp、X-gal、IPTG。4实验步骤实验整体流程如下：4.1质粒DNA的制备4.1.1质粒DNA的提取和纯化（1）挑去LB固体培养基上的但菌落，接种于200mLLB（含相应抗生素）液体培养基中，37℃、250r/min震荡培养过夜。（2）取3mL培养物于微量离心管中，室温离心，去尽液体。（3）将细菌沉淀重悬于200μl无菌水中，剧烈震荡，使菌体分散混匀。（4）加入400μl新鲜配置的溶液II，轻轻颠倒数次混匀。（5）加入300μl预冷的溶液III，颠倒数次，出现絮状白色沉淀后在冰上放置5min。（6）12000r离心15min，小心将上清液转移至另一离心管中。（7）向上清液中加入10μlRNA酶，37℃水浴酶切1h。（8）向酶切后的上清液中加入等体积的饱和酚，反复混匀，12000r/min离心10min，小心转移上清至另一离心管中。（9）向上清液中加入等体积的氯仿，反复混匀，12000r/min离心10min，小心转移上清至另一离心管中。（10）向上清液中加入等体积的异丙醇，混匀，冰上放置5—10min。12000r/min离心10min，弃去上清，并将离心管倒置用滤纸吸干所有液体。（11）用1ml70%乙醇洗涤沉淀1—2次，12000r/min离心2min，弃去上清，室温晾干是酒精充分挥发。（12）将沉淀溶于40μlddH2O，储存-20℃冰箱中。4.1.2琼脂糖凝胶电泳DNA检测（1）制备琼脂糖凝胶：将胶框和梳子装配好，水平放置，将约20ml琼脂糖凝胶溶液倒入胶框中，室温放置至凝胶凝固。（2）将凝胶移入电泳槽中，去除梳子，加入足量的1X电泳缓冲液。（3）取5μl质粒DNA样品与2μl加样缓冲液混匀，加入凝胶梳孔内，设置电压50V，电泳30min。（4）电泳结束后，取出凝胶，置于紫外投色仪中观察条带。4.2PCR扩增功能基因4.2.1PCR扩增基因（1）按PCR反应体系加入试剂：PCR反应体系双蒸水33.5μl10XPCR缓冲液5μlMg2+4μldNTPs（10mol/Leach）4μl引物11μl引物21μl模板DNA1μlDNA聚合酶0.5μl（2）PCR扩增条件：94℃，5分钟(预变性)94℃，30秒58℃，1分钟35个循环72℃，45秒72℃，10分钟（3）取5μlPCR产物按3.1.2的操作步骤对功能基因进行琼脂糖凝胶电泳检测。4.2.2功能基因的纯化（1）向扩增后的离心管中加入等体积的饱和酚，反复混匀，12000r/min离心10min，小心转移上清至另一离心管中。（2）向上清液中加入等体积的氯仿，反复混匀，12000r/min离心10min，小心转移上清至另一离心管中。（3）向上清液中加入等体积的异丙醇，混匀，冰上放置5—10min。12000r/min离心10min，弃去上清，并将离心管倒置用滤纸吸干所有液体。（4）用1ml70%乙醇洗涤沉淀1—2次，12000r/min离心2min，弃去上清，室温晾干使酒精充分挥发。（5）将沉淀溶于40μlddH2O，储存-20℃冰箱中。（6）取5μl功能基因水溶液按3.1.2的操作步骤对纯化后的功能基因进行琼脂糖凝胶电泳检测。4.3限制性酶切PCR产物及质粒（1）酶切反应体系如下，在0.5mL离心管中加入个组分PCR产物酶切体系质粒DNA酶切体系PCR产物35μl质粒DNA样品20μl10Xbuffer5μl10Xbuffer4μlRcoRI2.5μlRcoRI2.5μlBamHI2.5μlBamHI2.5μlddH2O5μlddH2O11μl总反应体系50μl总反应体系40μl（2）37℃水浴酶切过夜。（3）按步骤3.2.2对酶切产物纯化，将功能基因溶于12μl水中并取2μl纯化后酶切的产物按3.1.2的步骤对酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。4.4重组质粒的制备（1）按下表将链接反应复合物体系的各组分加入0.5ml的无菌离心管中。（2）将连接反应混合物置于16℃反应30min，得到链接产物。4.5氯化钙制备感受态和转化大肠杆菌（1）从37℃培养10小时的平板中挑取一个但菌落转到含有10mlLB250ml烧瓶中，37℃剧烈震荡培养3h。（2）用3支1.5ml灭菌的离心管分别取1.2ml的菌液，放在冰上冷却10min。（3）13000r/min离心10min，倒出培养液，流尽液体，回收细胞。（4）用1ml用0.1mol/LCaCl2悬浮洗涤细胞两次。（5）用0.2ml预冷的0.1mol/LCaCl2溶液重悬每份细胞沉淀。（6）向其中的一份感受态细胞悬液中加入3.4所获得重组DNA，轻轻旋转混合内容物，放置于冰上30min。第二份感受态细胞不加重组DNA，并与加重组DNA的感受态细胞采取相同的处理方式。第三份感受态细胞放入冰箱，备用。（7）将离心管放入42℃的循环水浴中，放置90s，然后快速转移到冰浴中，使细胞冷却2min。（8）每管加入800μlLB培养基，用水浴将培养基加热至37℃，然后转移至摇床，温育40min，试细菌复苏并表达质粒编码的抗生素抗性基因。4.6蓝白斑筛选重组质粒（1）将3.5获得转化子涂布于1号X—gal平板上。并将未加重组DNA的菌液涂布于2号X—gal平板上作为空白对照。（2）37℃恒温箱倒置培养16h。（3）含有重组质粒的菌株没有β-半乳糖苷酶活性，菌落形成白色菌落。5实验结果与讨论5.1质粒DNA提取的结果（1）质粒DNA经过碱裂法释放和纯化后，用琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图1质粒DNA条带不明显，而RNA条带非常明显。链接反应体系PCR产物7μlBuffer1μl质粒DNA1μl连接酶1μl图1质粒提取结果（2）条带宽度和颜色深浅与DNA的量相关，质粒DNA条带很浅表明提取量很少，而RNA条带明显则说明RNA含量高。出现这种情况的原因可能有：○1RNA酶失活，未起到酶切的效果。○2在碱裂后DNA变性处理时间过长导致加入溶液III后未能使其很好的复性；○370%酒精浓度不够，使部分质粒DNA溶解在水中，随着离心去上清而损失。○4操作过程不规范，导致大量的质粒DNA丢失。（3）质粒DNA的制备过程中还要注意的几个问题：○1加入溶液II、溶液III摇匀时一定要温和，不能剧烈摇动，以免基因组DNA断裂成小片段，从而混入质粒DNA中，影响质粒DNA的提取；○2在水饱和酚（氯仿）萃取吸取上清液时，应注意勿将下层酚（氯仿）吸入以免带入杂质。但也不要留下太多上清液，使质粒DNA损失较多。5.2功能基因PCR扩增的结果目的基因PCR扩增结果如图2，目的基因条带明显，表明目的基因扩增成功。图2目的基因扩增结