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基因工程实验报告学号姓名1实验目的(1)学习并掌握基因工程操作技术中最常用的载体质粒DNA的提取方法。(2)学习琼脂糖凝胶电泳分离DNA的原理和方法,检测质粒DNA的浓度与分子量。(3)了解PCR的基本原理,掌握PCR的基本操作技术。(4)学习利用限制性内切酶切割DNA的方法,并通过电泳检测酶切的效果。(5)学习DNA重组技术中的核心步骤,DNA片段之间的体外连接方法。(6)学习制备感受态细胞并将体外重组DNA引入受体细胞的技术。(7)掌握利用蓝白斑筛选出转化子的方法。2实验原理2.1质粒DNA提取的原理菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时,双链DNA氢键断裂,DNA双螺旋结构遭破坏而发生变性,但由于质粒DNA分子量相对较小,且呈环状超螺旋结构,即使在高碱性pH条件下,两条互补链也不会充分分离,当加入中和缓冲液调时,变性质粒DNA又恢复到原来的构型;而线性的大分子量的细菌染色体DNA则不能复性,与细胞碎片、蛋白质、SDS等形成不溶性复合物。当加入中和溶液后,质粒DNA能够迅速复性,呈溶解状态,离心时留在上清中;变形的蛋白质和DNA呈絮状,离心时可以沉淀下来。碱裂法获得的质粒DNA经过苯酚、氯仿抽提,RNA酶消化和乙醇沉淀除去残余的蛋白质和RNA,所得纯化的质粒DNA可满足实验要求。2.2PCR扩增功能基因的原理将反应体系(模板DNA、引物1、引物2、Mg2+、4种dNTP和TaqDNA聚合酶)置于高温(94℃)下变性,使模板双链DNA解链为两条单链。在低温(37~65℃)下退火,使引物与模板链3’端结合,形成部分双链DNA。在中温(~72℃)下,通过TaqDNA聚合酶使引物从5’端向3’端延伸,随着4种dNTP的掺入合成新的DNA互补链,完成第一轮变性、退火和聚合反应循环。反复进行这种变性、退火和聚合反应循环,可使两端引物限定范围内的DNA序列以指数形式扩增。循环的次数主要取决于模板的浓度,从理论上将一个目的DNA分子经20轮扩增后,可达106。2.3琼脂糖凝胶电泳检测DNA含量的原理琼脂糖是一种天然聚合长链状分子,沸水中溶解,45℃开始形成多孔性刚性滤孔,凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度。DNA分子在碱性环境中带负电荷,在外加电场作用下向正极泳动。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时,有电荷效应与分子筛效应。不同DNA,其分子量大小及构型不同,电泳时的泳动率就不同,从而分出不同的区带。琼脂糖凝胶电泳法分离DNA,主要是利用分子筛效应,迁移速度与分子量的对数值成反比关系。SYBRGold与DNA结合的亲和力高,且结合后能够极大的增强荧光信号。SYBRGold染料的最大激发波长为495nm,在300nm有第二个激发峰,其发射的荧光波长为537nm。2.4DNA的体外连接DNA连接酶催化两个双链DNA片段5’端磷酸和3’端羟基之间形成磷酸二酯键。2.5氯化钙制备感受态和转化大肠杆菌原理把外源DNA分子导入到某一宿主细菌细胞的过程称为转化(transformation)。当细菌处于容易吸收外源DNA的状态即感受态时,转化最易发生。常用的转化方法是用CaCl2处理受体菌,使细菌细胞进入敏感的感受态。当细菌处于冰冻(0℃)的CaCl2溶液中,细菌细胞膨胀成球形,转化混合物中的DNA形成抗DNase的羧基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面,经42℃短时间热冲击处理,促进细胞吸收外源DNA。2.6蓝白斑筛选重组质粒原理原理lacZ编码β-半乳糖苷酶,受lac启动子调控,当E.coli菌株表达lac阻抑物,则载体上的lacZ基因由IPTG诱导表达,表达形成的酶可以利用X-gal形成蓝色化合物。重组质粒中lacZ插入失活导致不能形成蓝色菌落。3实验试剂及设备3.1实验设备台式离心机、旋涡振荡器、恒温水浴锅、微波炉、电泳仪、电泳槽、凝胶成像检测仪、超净工作台、冰箱、恒温摇床、离心管、移液枪、枪头、冰盒、加样板、量筒100ml、三角瓶500ml、培养皿、锥形瓶150ml、烧杯3.2质粒DNA制备的试剂(1)LB培养基:胰蛋白胨10g,NaCl10g,酵母膏5g,pH7.5,加水1L,高压灭菌。(2)含pBluescriptSK(-)质粒的大肠杆菌。(3)100mg/ml氨苄青霉素水溶液。(4)TE:10mmol/LTris-HCl(pH7.8)—1mmol/LEDTA(pH8.0)。(5)无菌超纯水。(6)溶液II:1%SDS(电泳级)-0.2mol/LNaOH。(7)溶液III:3mol/L醋酸钠溶液(40.8gNaAc.3H2O溶于60mL水中,加入11.5mL冰醋酸,定容至100Ml,高压灭菌,pH4.8。)(8)20mg/mLRNA酶液。(9)水饱和酚。(10)70%乙醇。(11)异丙醇。3.3琼脂糖凝胶电泳的试剂(1)琼脂糖1%(2)加样缓冲液(3)Maker(4)电泳缓冲液(10X):Tris242g,冰醋酸57.1ml,EDTA.Na2.2H2O37.2g,加水至1L。(5)SYBRGold3.4PRC反应的试剂(1)10XPCR反应缓冲液(2)四种核苷酸混合物(dNTPs),10mol/L(3)寡核苷酸(PCR引物)(4)模板DNA(5)DNA聚合酶3.5酶切反应及质粒重组的试剂(1)10Xbuffer(2)酶:RcoRI、BamHI(3)ddH2O(4)DNA连接酶3.6感受态的制备、大肠杆菌的转化和重组质粒的筛选的试剂CaCl2、LB培养基、LB培养基-Amp、X-gal、IPTG。4实验步骤实验整体流程如下:4.1质粒DNA的制备4.1.1质粒DNA的提取和纯化(1)挑去LB固体培养基上的但菌落,接种于200mLLB(含相应抗生素)液体培养基中,37℃、250r/min震荡培养过夜。(2)取3mL培养物于微量离心管中,室温离心,去尽液体。(3)将细菌沉淀重悬于200μl无菌水中,剧烈震荡,使菌体分散混匀。(4)加入400μl新鲜配置的溶液II,轻轻颠倒数次混匀。(5)加入300μl预冷的溶液III,颠倒数次,出现絮状白色沉淀后在冰上放置5min。(6)12000r离心15min,小心将上清液转移至另一离心管中。(7)向上清液中加入10μlRNA酶,37℃水浴酶切1h。(8)向酶切后的上清液中加入等体积的饱和酚,反复混匀,12000r/min离心10min,小心转移上清至另一离心管中。(9)向上清液中加入等体积的氯仿,反复混匀,12000r/min离心10min,小心转移上清至另一离心管中。(10)向上清液中加入等体积的异丙醇,混匀,冰上放置5—10min。12000r/min离心10min,弃去上清,并将离心管倒置用滤纸吸干所有液体。(11)用1ml70%乙醇洗涤沉淀1—2次,12000r/min离心2min,弃去上清,室温晾干是酒精充分挥发。(12)将沉淀溶于40μlddH2O,储存-20℃冰箱中。4.1.2琼脂糖凝胶电泳DNA检测(1)制备琼脂糖凝胶:将胶框和梳子装配好,水平放置,将约20ml琼脂糖凝胶溶液倒入胶框中,室温放置至凝胶凝固。(2)将凝胶移入电泳槽中,去除梳子,加入足量的1X电泳缓冲液。(3)取5μl质粒DNA样品与2μl加样缓冲液混匀,加入凝胶梳孔内,设置电压50V,电泳30min。(4)电泳结束后,取出凝胶,置于紫外投色仪中观察条带。4.2PCR扩增功能基因4.2.1PCR扩增基因(1)按PCR反应体系加入试剂:PCR反应体系双蒸水33.5μl10XPCR缓冲液5μlMg2+4μldNTPs(10mol/Leach)4μl引物11μl引物21μl模板DNA1μlDNA聚合酶0.5μl(2)PCR扩增条件:94℃,5分钟(预变性)94℃,30秒58℃,1分钟35个循环72℃,45秒72℃,10分钟(3)取5μlPCR产物按3.1.2的操作步骤对功能基因进行琼脂糖凝胶电泳检测。4.2.2功能基因的纯化(1)向扩增后的离心管中加入等体积的饱和酚,反复混匀,12000r/min离心10min,小心转移上清至另一离心管中。(2)向上清液中加入等体积的氯仿,反复混匀,12000r/min离心10min,小心转移上清至另一离心管中。(3)向上清液中加入等体积的异丙醇,混匀,冰上放置5—10min。12000r/min离心10min,弃去上清,并将离心管倒置用滤纸吸干所有液体。(4)用1ml70%乙醇洗涤沉淀1—2次,12000r/min离心2min,弃去上清,室温晾干使酒精充分挥发。(5)将沉淀溶于40μlddH2O,储存-20℃冰箱中。(6)取5μl功能基因水溶液按3.1.2的操作步骤对纯化后的功能基因进行琼脂糖凝胶电泳检测。4.3限制性酶切PCR产物及质粒(1)酶切反应体系如下,在0.5mL离心管中加入个组分PCR产物酶切体系质粒DNA酶切体系PCR产物35μl质粒DNA样品20μl10Xbuffer5μl10Xbuffer4μlRcoRI2.5μlRcoRI2.5μlBamHI2.5μlBamHI2.5μlddH2O5μlddH2O11μl总反应体系50μl总反应体系40μl(2)37℃水浴酶切过夜。(3)按步骤3.2.2对酶切产物纯化,将功能基因溶于12μl水中并取2μl纯化后酶切的产物按3.1.2的步骤对酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。4.4重组质粒的制备(1)按下表将链接反应复合物体系的各组分加入0.5ml的无菌离心管中。(2)将连接反应混合物置于16℃反应30min,得到链接产物。4.5氯化钙制备感受态和转化大肠杆菌(1)从37℃培养10小时的平板中挑取一个但菌落转到含有10mlLB250ml烧瓶中,37℃剧烈震荡培养3h。(2)用3支1.5ml灭菌的离心管分别取1.2ml的菌液,放在冰上冷却10min。(3)13000r/min离心10min,倒出培养液,流尽液体,回收细胞。(4)用1ml用0.1mol/LCaCl2悬浮洗涤细胞两次。(5)用0.2ml预冷的0.1mol/LCaCl2溶液重悬每份细胞沉淀。(6)向其中的一份感受态细胞悬液中加入3.4所获得重组DNA,轻轻旋转混合内容物,放置于冰上30min。第二份感受态细胞不加重组DNA,并与加重组DNA的感受态细胞采取相同的处理方式。第三份感受态细胞放入冰箱,备用。(7)将离心管放入42℃的循环水浴中,放置90s,然后快速转移到冰浴中,使细胞冷却2min。(8)每管加入800μlLB培养基,用水浴将培养基加热至37℃,然后转移至摇床,温育40min,试细菌复苏并表达质粒编码的抗生素抗性基因。4.6蓝白斑筛选重组质粒(1)将3.5获得转化子涂布于1号X—gal平板上。并将未加重组DNA的菌液涂布于2号X—gal平板上作为空白对照。(2)37℃恒温箱倒置培养16h。(3)含有重组质粒的菌株没有β-半乳糖苷酶活性,菌落形成白色菌落。5实验结果与讨论5.1质粒DNA提取的结果(1)质粒DNA经过碱裂法释放和纯化后,用琼脂糖凝胶电泳检测,结果如图1质粒DNA条带不明显,而RNA条带非常明显。链接反应体系PCR产物7μlBuffer1μl质粒DNA1μl连接酶1μl图1质粒提取结果(2)条带宽度和颜色深浅与DNA的量相关,质粒DNA条带很浅表明提取量很少,而RNA条带明显则说明RNA含量高。出现这种情况的原因可能有:○1RNA酶失活,未起到酶切的效果。○2在碱裂后DNA变性处理时间过长导致加入溶液III后未能使其很好的复性;○370%酒精浓度不够,使部分质粒DNA溶解在水中,随着离心去上清而损失。○4操作过程不规范,导致大量的质粒DNA丢失。(3)质粒DNA的制备过程中还要注意的几个问题:○1加入溶液II、溶液III摇匀时一定要温和,不能剧烈摇动,以免基因组DNA断裂成小片段,从而混入质粒DNA中,影响质粒DNA的提取;○2在水饱和酚(氯仿)萃取吸取上清液时,应注意勿将下层酚(氯仿)吸入以免带入杂质。但也不要留下太多上清液,使质粒DNA损失较多。5.2功能基因PCR扩增的结果目的基因PCR扩增结果如图2,目的基因条带明显,表明目的基因扩增成功。图2目的基因扩增结
本文标题:基因工程-实验报告
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