端粒和端粒酶

端粒和端粒酶TelomeresandEnzymeTelomerase武汉大学药学院郝春霖B端粒酶telomeraseC科学思想ScientificthoughtsA端粒telomeresPuzzles1DNA聚合酶特点(引物方向5’→3’)染色体复制之初可以由小RNA作引物起始合成,之后DNA聚合酶能以反链DNA为模板,以前合成的DNA为引物,合成新的DNA取代染色体中间的RNA引物;线性染色体最末端的RNA引物无法被取代;末端隐缩Assumptions1.复制前联体、环化（linear→circle）2.发卡结构3.可变末端（alterableterminal）多个短重复序列(shortrepetitivesequences)4.蛋白质干预Puzzles21939年,潜心玉米遗传性状研究的BarbaraMcClintock(因发现玉米的转座子获诺贝尔学奖)注意到:在减数分裂后期偶然产生的染色体断裂很容易重新融合起来形成“桥”,在紧接着的有丝分裂中,这种染色体“断裂---融合---桥---断裂”的循环不断继续。为什么染色体的自然末端不容易相互融合？染色体的自然末端不同于非正常的DNA断裂末端,它有一个特殊的结构来避免染色体之间的相互融合.科学家HermannMuller将这种特殊结构命名为端粒(Telomere,在希腊语中,telos表示末端,meros表示片段).AssumptionsExperiments四膜虫JackSzostakElizabethBlackburn人工染色体四膜虫四膜虫是一种特殊的模式生物，有两个细胞核。小核很稳定，含5对染色体，用于生殖传代；而大核在接合细胞的发育过程中，染色体可断裂成200—300个小染色体，端粒非常丰富。ElizabethBlackburn1978年，ElizabethBlackburn利用四膜虫纯化了rDNA,以rDNA为模板通过体外合成掺入dNTP的实验，推断出四膜虫的染色体上有由许多重复的5’-CCCCAA-3’六碱基序列组成的特殊结构区域，此区域即端粒。人工染色体1980年，ElizabethBlackburn在会议上对这一重大发现的报告,引起了JackSzostak的极大兴趣。他那时候正试图在酿酒酵母中构建人工线性染色体，让它能够在细胞中像自然染色体一样复制。但当环状质粒线性化并转入细胞后，很快就被降解掉。端粒序列的发现使JackSzostak有机会把线性质粒末端连接到四膜虫的端粒DNA，然后再倒入酵母细胞中。奇迹发生了：线性质粒不再被降解，而是在细胞内稳定存在并复制。这是人工染色体的最早雏形，它使得DNA的大片段克隆成为可能，后来为人类基因组测序工作立下了汗马功劳。人工染色体端粒----稳定线性染色体的末端结构Def.存在于染色体末端的一段特殊的DNA重复序列端粒和端粒结合蛋白组成核蛋白复合物，广泛存在于真核生物细胞中；不同种类细胞的端粒重复单位不同，大多长约5—8bp;端粒的结构与功能具有保守性.端粒的功能ABCDETPE效应固定染色体位置保护染色体末端防止染色体复制时丢失决定细胞寿命端粒酶活性的发现Liz女士的实验室在研究四膜虫端粒序列的过程中还发现了一个有趣的现象:带着四膜虫端粒DNA的人工染色体导入到酵母后,被加上了酵母的端粒而不是四膜虫的端粒序列.由于端粒是由重复序列组成的,当时人们普遍猜想同源重组是延伸端粒补偿染色体末端隐缩的机制.但是同源重组只能复制出更多本身的序列,为什么在四膜虫端粒上加的是酵母的端粒序列而不是四膜虫本身的序列呢?这个现象是同源重组无力解释的.ElizabethBlackburn和CarolGreider的实验四膜虫在接合细胞的大核发育过程中,大核产生了非常丰富的小染色体,每一个小染色体都在末端加上了端粒,可以推测:如果“酶”的假说成立,此时细胞内的酶活性应该是非常高的.用四膜虫的核抽提液与体外的端粒DNA进行温育,试图在体外检测到这个酶的活性,看到端粒的延伸.ElizabethBlackburn和CarolGreider的实验经过不断优化条件,尤其是把底物换成体外合成的高浓度的端粒DNA后,Carol通过曝光x光片,清楚地看到了“酶”的活性:在测序胶的同位素曝光片上,端粒底物明显被重新加上了DNA碱基,而且每六个碱基形成一条很深的带,与四膜虫端粒重复基本单位为六个碱基正好吻合.ElizabethBlackburn和CarolGreider的实验这种酶活性不依赖于DNA模板,只对四膜虫和酵母的端粒DNA进行延伸,而对随即序列的DNA底物不延伸;并且该活性不依赖于DNA聚合酶.而同源重组对序列没有特异性要求,并且依赖于DNA聚合酶的活性.至此,她们澄清了这两种假说,证明了有一种酶来延伸端粒DNA,即端粒酶(telomerase)ElizabethBlackburn和CarolGreider的实验NobelPrizeinMedicineAwardedforCreakingDNAPuzzle端粒酶亚基Liz实验室与TomCech合作,对端粒酶活性进一步定性.用RNA酶处理样品,降解样品的RNA→酶活性消失用蛋白酶消化→酶活性消失RNA亚基有一段RNA序列正好和四膜虫的端粒DNA序列互补,端粒酶正式利用RNA亚基的这段序列作为模板重复复制出端粒DNA端粒酶RNA亚基的发现DanielGottschling利用TPE效应设计出实验,筛选酵母RNA亚基基因:把URA和ADE连个基因通过遗传重组的方法置入端粒区域,由于TPE效应,URA和ADE不表达.酵母只能在含有uracil的培养基中生长,且克隆是红色的.再转入cDNA表达库,某些调控端粒长度的基因通过过表达可以改变端粒的长度.如果端粒长度变得足够短,TPE效应就会消失,URA和ADE两个基因就会启动表达.这种短端粒的酵母能够在不含有uracil的培养基中生长,并且酵母克隆显示出白色端粒酶RNA亚基的发现端粒酶催化亚基端粒酶既然能够利用RNA模板亚基来复制DNA,那么很容易推测这个蛋白亚基可能具有RNAdependentDNApolymerase活性(依赖于RNA的DNA聚合酶活性),即逆转录酶活性.更进一步说,它的蛋白质序列里应该包含逆转录酶特有的结构区域.ETS1ETS2ETS3ETS4(CD13)体外转录和翻译系统共表达了端粒酶的催化亚基和RNA亚基,在体外重建了端粒酶活性Nature:端粒酶的活化成功逆转未老先衰实验鼠衰老过程哈佛科学家最近破天荒地令年老的老鼠器官获得新生，成功逆转衰老过程，这项突破成果或有望防治脑退化症(老人痴呆症)、糖尿病和心脏病等疾病，甚至有望打开永恒青春的奥秘，进一步迈向研制“长生不老药”。研究员饲养了一些经基因改造的老鼠，令它们因缺乏“端粒”而未老先衰，出现嗅觉衰退、脑部缩小、不育、肠部和脾脏受损等疾病，使它们皮肤、大脑、内脏和其它器官老化。将这些老鼠分为两组，把一种名为“TERT”的定时释放药物，植入其中一组老鼠的皮下，重启它们体内休眠的“端粒”基因。结果在短短2个月内，有注射TERT的老鼠体内长出许多新的细胞，主要器官运作功能改善，身体差不多完全“返老还童”，当中雄性的老鼠更恢复生育功能。实验鼠最终活到正常鼠的寿命，但并不比普通鼠寿命长。进行研究的德皮尼奥博士表示，实验鼠对人类而言，就像一个40岁的人，身体未老先衰像80多岁的老人，而这项实验逆转衰老过程，把他变回50岁一般。德皮尼奥说：“这些是严重衰老的动物，但经过一个月治疗后，它们已有具体康复迹象，包括脑部长出新的细胞。”他指出，这是首次有老鼠实验成功把衰老过程逆转，意味着一些老化的器官也有“重生”的可能。不过，要把这一科技应用于人体身上将会较为困难，老鼠一生中都能制造端粒，但是人类到成年后便会自动“关掉”这种，从而阻止细胞增长失控，以免转化成癌症。因此，提升人体的“端粒”水平虽然或有助减缓衰老速度，但同时增加患癌的风险。德皮尼奥认为，“TERT”疗法如果是分阶段进行，和只用于身体没有癌细胞及较为年青的人身上，疗法或对人体安全。牛津大学生物化学家考克斯认为，这项研究“非常重要”，证明原则上短期恢复成人体内的“端粒”，能令年老的组织重生和恢复生理功能。科学思想PuzzlesAssumptions模式生物生化技术静心阅读文献和缜密思考,找出问题的关键,并对课题进行精心讨论和设计Timewilltellwhichconnectionsbetweentelomeraseandhealthwillendure…Wedidnotsetouttofindanewapproachtocancertherapyorstudyspecificdiseasemechanisms.Weweresimplyinterestedinhowchromosomesaremaintained…Yetthehistoryofmedicineisfilledwithexamplesofadvancesfromimprobableplaces.Thanks