重庆大学组织培养-细胞原代培养及细胞培养的污染

细胞原代培养及细胞培养的污染概念细胞培养：是从生物体中取出某种器官、组织或细胞，在体外模拟体内生理条件对其进行培养，使之生长和繁殖的术方法。其分为原代培养和传代培养。原代培养：原代培养也称初代培养，严格的说即从体内取出组织接种培养到第一次传代阶段，但实际上，通常把第一代至第十代以内的培养细胞统称为原代细胞培养。一般持续1一4周。此期细胞呈活跃的移动，可见细胞分裂，但不旺盛。传代培养：指原代细胞增殖到一定密度之后，经处理，转移到其他培养瓶中继续的扩大培养，其积累的次数即为细胞的代数。最常用的原代培养有组织块培养和分散细胞培养组织块培养是将剪碎的组织块直接移植在培养瓶壁上，加入培养基后进行培养。分散细胞培养则是将组织块用机械法或化学法细胞分散。器材：培养瓶，解剖剪，解剖镊，培养瓶，培养皿，移液管，吸管，离心管，酒精灯，75％酒精棉球，记号笔，恒温培养箱，超净工作台，乳鼠。试剂：培养液RPMI1640，小牛血清，Hanks液75％酒精。实验材料实验步骤1、处死乳鼠用镊子使其窒息而死即可,断颈法等2、消毒乳鼠浸入75%酒精中2-3s，带回超净工作台。3、取材用消毒过的解剖剪取乳鼠内脏，放入培养皿中，用PBS溶液漂洗组织3次。4、剪碎将组织剪碎至0.5～1mm3的小块，加入2滴小牛血清，吹打均匀制成悬液。5、接种用吸管吸取悬液，均匀排种在培养瓶底壁。6、培养翻转180°使瓶底向上，加入1～2ml培养液1640，拧紧瓶盖后置于恒温箱中培养30min，再翻转过来，加入2ml左右培养液置恒温箱中培养。7、观察3d后对培养的细胞进行观察。取材修剪冲洗→剪切成1mm3小块→移入培养瓶→分布组织小块间距5mm→翻转培养瓶并加入适量培养液，37℃静置2-4h→翻正培养瓶进行培养→原代细胞生长组织培养法注意事项1、整个实验过程要保持所有的组织细胞处于无菌条件。2、操作前要洗手，进入超净工作台后要用75%酒精擦拭双手。3、器材使用时既要注意用火焰消毒，又要防止烫伤、烫死细胞。4、吸溶液的吸管等不能混用，以免交叉污染。细胞培养的污染、检测和排除•凡混入细胞培养环境中对细胞生存有害的成分和造成细胞不纯的异物都应视为污染•细胞污染不能完全被消除，但能减少其发生的频率和后果的严重性简介•细胞污染的分类–物理污染–化学污染–生物污染（支原体污染）•控制污染–掌握良好的无菌操作技术–建立细胞库–合理应用抗生素–保持工作区清洁–建立良好的规章制度–检测细胞污染要点物理污染•温度–孵箱放在温度较恒定的房间中–培养液从冰箱取出后在室温放置•放射线–试剂周围不能放同位素•振动–孵箱周围不能放引起振动的设备•辐射–试剂不要放在带有玻璃门的冰箱中化学污染•血清–新购买的血清用之前要试–应选用同一批次的血清•培养液及试剂–选用纯度最高的试剂–经过权威机构认定–正确的储存方法化学污染•容器–生产过程中有毒物质残留–消毒剂和清洗剂的残留–铝箔和包裹纸残留•孵箱–co2混有有毒气体–消毒剂和清洗剂的残留–对实验人员是一个潜在的危险因素•细胞系交叉污染–污染在这是个错误的用词–难于发现–若出现传代细胞的生长速度异常，考虑交叉污染–同一时间只传同一种细胞–每种细胞要有单独的液体–建立细胞库每三个月更换一次细胞生物污染•细菌、霉菌和酵母–无抗生素污染易被发现–抗生素存在易造成隐性污染–隐性污染引起严重后果•病毒–最难发现和清除–严格的宿主性–自限性生物污染•支原体（杂草）•难发现难去除–显微镜看不到–不引起培养液浑浊和PH改变–营养要求高不容易用传统的微生物培养法检测到–不能通过过滤清除–大多数抗生素对其无效•污染严重生物污染•支原体检测方法方法敏感性优点缺点直接DNA染色(如Hoechst33258)低快速，便宜需要荧光显微镜结果不易解释指示细胞上间接DNA染色(如Vero)中放大污染结果易解释费时免疫荧光单克隆抗体易操作灵敏需要荧光显微镜肉汤和琼脂培养高灵敏慢需要专业解释ELISA中快速检查种类有限PCR中-高特异性强快速需要PCR设备生物污染树立“预防为主”的思想保证细胞来源干净确保基质和器材无菌严格无菌操作细胞培养时避免交谈操作结束时消毒台面每船15代的细胞应更换所有细胞培养材料丢弃前应高压消毒控制污染良好的无菌操作合理利用抗生素建立细胞库良好的规章制度保持工作区清洁细胞污染的检测