实验常规仪器的使用

20年代：微量分析技术导致了维生素、激素和辅酶等的发现。瑞典著名的化学家T.Svedberg奠基了“超离心技术的理论基础，1924年制成了第一台5000RCF的离心机（5000r/min-8000r/min，相对离心力“RCF”的单位可表示为“×g”)，并准确测定了血红蛋白等复杂蛋白质的分子量，获得了1926年的诺贝尔化学奖。。1.1生物化学实验技术发展简史30年代：电子显微镜技术打开了微观世界，使我们能够看到细胞内的结构和某些生物大分子的大致结构。美国哈佛大学的Folin教授和中国的吴宪教授建立了不少生物化学常用的分析方法如血糖分析、蛋白质含量分析、氨基酸测定等。英藉德裔生物化学家Krebs，在1937年发现了三羧酸循环，对细胞代谢及分子生物学的研究作出了重要贡献，他与美藉德裔生物化学家Lipmann共获1953年诺贝尔生理医学奖。40年代：两位英国科学家Martin和Synge发明了分配色谱（层析），他们获得了1952年的诺贝尔化学奖。由此，层析技术成为分离生化物质的关键技术。电泳技术由瑞典的著名科学家Tisellius奠基，从而开创了电泳技术的新时代，他因此获得了1948年的诺贝尔化学奖。层析技术和电泳技术用于分析生物大分子的组成和代谢的中间产物，示踪技术的应用推动了代谢的研究。美国化学家Pauling确认氢键在蛋白质空间结构中以及生物大分子间相互作用的重要性等，并因此而获得了诺贝尔化学奖。50年代：自1935年Schoenheimer和Rittenberg首次将放射性同位素示踪用于碳水化合物及类脂物质的中间代谢的研究以后，射性同位素示踪技术50年代有了大的发展，为各种生物化学代谢过程的阐明起了决定性的作用。1953年美国科学家Watson和英国科学家Crick提出DNA分子反向平行双螺旋模型，1962年与英国科学家Wilkins分享诺贝尔生理医学奖，Wilkins和Franklin通过对DNA分子的X-射线衍射研究为Watson和Crick的DNA模型提供了有力的实验证据，DNA双螺旋模型的提出开创了生物科学的历史新纪元。在X-射线衍射技术方面，英国物理学家Perutz对血红蛋白的结构进行X-射线结构分析,Kendrew测定了肌红蛋白的结构，成为研究生物大分子立体结构的先驱，他们同获1962年诺贝尔化学奖。英国生物化学家Sanger还于1953年确定了牛胰岛素中氨基酸的顺序而获得1958年的诺贝尔化学奖。Kornberg发现了DNA聚合酶Ⅰ，美藉西班牙裔科学家Uchoa发现了细菌的多核苷酸磷酸化酶，研究并重建了将基因内的遗传信息通过RNA中间体翻译成蛋白质的过程。两人分享了1959年诺贝尔生理医学奖。60年代：各种仪器分析方法用于生物化学研究，取得了很大的发展，如HPLC技术、红外、紫外、圆二色等光谱技术、NMR核磁共振技术等。自1958年Stem，Moore和Spackman设计出氨基酸自动分析仪，大大加快了蛋白质的分析工作。1967年Edman和Begg制成了氨基酸序列分析仪，到1973年Moore和Stein设计出氨基酸序列自动分析仪，又大大加快了对多肽一级结构的测定，十多年间氨基酸的自动测定工作得到了很大的发展和完善。在60年代，层析和电泳技术又有了重大的进展，在1968-1972年Anfinsen创建了亲和层析技术，开辟了层析技术的新领域。1969年Weber应用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳技术测定了蛋白质的相对分子质量，使电泳技术取得了重大进展。美国生物化学家Nirenberg在破译遗传密码方面作出了重要贡献，Holly阐明了酵母丙氨酸tRNA的核苷酸排列顺序，后来证明所有tRNA的结构均相似。美藉印度裔生物化学家Khorana提出按预定的序列合成核酸分子的方法。他们3人共获1969年诺贝尔生理医学奖。法国生物学家Lwoff、JAcob和生物化学家Monod由于在病毒DNA和mRNA等方面出色的大量研究工作而共获1965年诺贝尔生理医学奖。70年代：基因工程技术取得了突破性的进展，Arber，Smith和Nathans三个小组发现并纯化了限制性内切酶，1972年，美国斯坦福大学的Berg等人首次用限制性内切酶切割了DNA分子，并实现了DNA分子的重组。1973年，又由美国斯坦福大学的Cohen等人第一次完成了DNA重组体的转化技术，这一年被定为基因工程的诞生年，Cohen成为基因工程的创始人，从此，生物化学进入了一个新的大发展时期。与此同时，各种仪器分析手段进一步发展，制成了DNA序列测定仪、DNA合成仪等。80年代基因工程技术进入辉煌发展的时期，1980年，英国剑桥大学的生物化学家Sanger和美国哈佛大学的Gilbert分别设计出两种测定DNA核苷酸序列的方法，而与Berg共获诺贝尔化学奖，从此，DNA序列分析法成为生物化学与分子生物学最重要的研究手段之一。他们3人在DNA重组和RNA结构研究方面都作出了杰出的贡献。1981年由Jorgenson和Lukacs首先提出的高效毛细管电泳技术（HPCE），由于其高效、快速、经济，尤其适用于生物大分子的分析，因此受到生命科学、医学和化学等学科的科学工作者的极大重视，发展极为迅速，是生化实验技术和仪器分析领域的重大突破，意义深远。现今，由于HPCE技术的异军突起，HPLC技术的发展重点己转到制备和下游技术。1984年德国科学家Kohler、美国科学家Milstein和丹麦科学家Jerne由于发展了单克隆抗体技术，完善了极微量蛋白质的检测技术而共享了诺贝尔生理医学奖。1985年美国加利福尼亚州Cetus公司的Mullis等发明了用PCR技术（PolymeraseChainReaction）即聚合酶链式反应扩增DNA的技术，对于生物化学和分子生物学的研究工作具有划时代的意义，因而与第一个设计基因定点突变的Smith共享1993年的诺贝尔化学奖1988年，美国遗传学家McClintock由于在二十世纪五十年代提出并发现了可移动的遗传因子而获得诺贝尔生理医学奖。1989年，美国科学家Altman和Cech由于发现某些RNA具有酶的功能（称为核酶）而共享诺贝尔化学奖。90年代：1993年，美国科学家Roberts和Sharp由于在断裂基因方面的工作而荣获诺贝尔生理医学奖。1994年，美国科学家Gilman和Rodbell由于发现了G蛋白在细胞内信息传导中的作用而分享诺贝尔生理医学奖。1995年，美国科学家Lewis、德国科学家Nusslein-Volhard和美国科学家Wieschaus由于在20世纪40-70年代先后独立鉴定了控制果蝇体节发育基因而共享诺贝尔生理医学奖。进入21世纪以来，PCR技术、生物芯片技术不断完善，基因组学、蛋白质组学、生物信息学发展迅速。我国生物化学界的主要成就我国生物化学界的先驱吴宪教授在20年代初由美回国后，在协和医科大学生化系与汪猷、张昌颖等人一道完成了蛋白质变性理论、血液生化检测和免疫化学等一系列有重大影响的研究。1965年我国化学和生物化学家用化学方法在世界上首次人工合成了具有生物活性的结晶牛胰岛素，1983年又通过大协作完成了酵母丙氨酸转移核糖核酸的人工合成。近年来，在酶学研究、蛋白质结构及生物膜的结构与功能等方面都有举世瞩目的研究成果。90年代以来，我国参与了人类基因组计划，在水稻基因组研究中处于国际领先水平，在功能基因组学研究中取得不少成绩。1.2生化实验室的基本设施与装备温度与环境设施许多生化实验都要求在一定的温度和湿度下进行操作，因此，一个正规的生化实验室必须能够保持恒温、恒湿的环境。为了保持这些条件，实验室都应装备空调和加湿器等，而仪器分析室则要求保持干燥，一些怕潮湿和易水解的试剂应保存在干燥箱中。由于各种生物材料、制剂和各种生化试剂要求在不同的温度下保存，实验室必须备有4℃、－20℃、－80℃的冰箱，需要在更低温度下保存的样品，则须使用液氮罐。对于需在较高温度下进行的操作，则可使用烘箱和高温电炉等。实验室还应备有干冰，以便使用乙醇-干冰浴进行样品的快速冷冻分装。实验室用纯水生化实验室使用最多的溶剂是“水”，配制生化实验用试剂不能用自来水，只能使用经过纯化的水。生化实验对所用水的纯度是要求比较高的，通常可以认为，水的质量越高，实验的结果就越真实可靠和准确，为此必须保证实验用水的质量。常用的两种纯水是二次蒸馏水和无离子水。在超纯分析和特殊的生化实验中要求更高的水质，如无菌水、亚沸蒸馏水、无二氧化碳蒸馏水等。根据实际工作的需要，来选用水的种类，如：无离子水、普通蒸馏水、二次蒸馏水、亚沸蒸馏水及按特殊要求制备的高纯水等。所有的各种纯水，在贮存中都会被污染：塑料容器会产生有紫外吸收的有机物；玻璃和金属容器会产生金属离子的污染；长时间放置更会使水长菌，空气中的二氧化碳会溶入水中，所以贮存高纯水一定要隔绝空气，密封盖严，必要时贮存在冰箱的冷藏室中。消毒系统生化实验要进行生物培养和生物反应的操作，这些操作都必须排除其他生物因素的干扰，因此在做这些实验之前，都必须对实验中用到的、可能造成污染的材料、器械等进行消毒灭菌处理。常用的灭菌方法有：高温、高压灭菌、紫外线照射、火焰焚烧、过滤除菌、酒精等试剂浸泡消毒等，因此实验室必须配备各种无菌处理设备。离心设备离心方法是分离和制备生物大分子最常用的手段，因而生化实验室必须备有各种形式的离心机。常用的有普通台式离心机、高速冷冻离心机和超速离心机等。计量系统生化实验都要求在各种标准的定量条件下进行，因此实验室必须配备各种标准的定量系统。常用的定量系统有：称量系统、液体体积度量系统、pH测定系统、液体溶质定量系统等。⑴称量仪器：最常用的设备是各种千分之一的扭力天平、单、双盘天平和各种万分之一的电子天平等，它们分别用于各种缓冲液的配制和标准物质的称量等。⑵液体体积度量仪器：常用的有各种量筒、移液管、容量瓶、微量进样器和各种自动取液器等。⑶酸碱度pH测量仪器：最常用的是pH试纸和pH计。⑷液体溶质定量仪器：此系统主要是根据液体溶质的某些理化特性而设计的，不同的物质在一定的条件下有特定的吸收光谱，其吸收值的大小与其在溶液中的浓度有一定的关系，可以通过测定某物质在溶液中的吸收光谱来计算出该物质的浓度，因而分光光度计就是生化实验室必备的仪器分析手段。主要有可见分光光度计和高档的快速扫描紫外／可见分光光度计等。电泳装置电泳是生化实验中最常用最重要的实验技术之一，主要用于分析、鉴定，也可用于制备。电泳装置由电源和电泳槽两部分组成，详见第4章。层析系统层析又称为色谱，是分离各种生物大分子的主要手段之一，因而各种层析系统和核酸蛋白检测器就是生化实验室最常用的仪器设备。主要的层析技术有：吸附层析、凝胶排阻层析、离子交换层析和亲和层析等，详见第3章。PCR仪PCR(PolymeraseChainReaction)是指聚合酶链式反应。该反应是用DNA聚合酶在体外大量扩增DNA片段的一种方法。PCR仪就是将此方法实现了自动化操作的一种仪器，是生化与分子生物学实验常用和必备的设备。其它设备实验室除以上常规设备和设施外，还必须装备下列一些常用设备：A.通风柜：用于有害和有毒气体的操作。B.微波炉：用于化冻、灭菌及其他一些需要快速加热的操作。C.组织打碎机和匀浆器：用于各种生物材料、动植物组织和细胞的破碎。D.超声清洗机：用于各种器皿、移液管和自动取液器吸头的清洗和高效液相色谱仪所用流动相的脱气等。E.冰冻干燥机：用于生物大分子水溶液的冰冻干燥，可由其水溶液直接制得固体干粉。F.机械和水环式真空泵：用于旋转蒸发器和各种真空抽气操作。G.旋转蒸发器：用于各种水溶液和有机溶液的旋转减压蒸馏操作。H.酶标仪：用于免疫化学实验的酶联免疫吸附测定。绝对误差（absoluteerror）：绝对误差是测量值与真实值之差。δ=x−μ(δ：绝对误差；x：测量值；μ：真实值）绝对误差是以测量值的单位为单位，可以是正值，也可以是负值。测量值越接近真实值，绝对误差越小。真实值是一个可以接近而不可达到的理论值。上式可以写成：μ=x-δ说明在已知绝