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高速逆流色谱技术应用现状Applicationactualityofhigh-speedcountercurrentchromatography(HSCCC)刘迪1陈雪峰1宋晓宇2LIUDi1CHENXue-feng1SONGXiao-yu2(1.陕西科技大学生命科学与工程学院,陕西咸阳712081;2.陕西海升果业发展股份有限公司,陕西咸阳713300)(1.DepartmentofLifeScienceandEngineering,ShaanxiUniversityofScienceandTechnology,Shaanxi,Xianyang712081,China;2.ShaanxiHaishengFreshJuiceCo.Ltd,Shaanxi,Xianyang713300,China)摘要:综述了高速逆流色谱技术(HSCCC)原理及特点,溶剂体系的选择,影响分离效果的因素,与之相联的检测技术及其应用现状。关键词:高速逆流色谱(HSCCC);溶剂体系;分离;检测;应用Abstract:Thispaperreviewstheprinciple,characteristic,choiceoftwo-phasesolventsystems,factorsofeffectingseparetionimpact,checkingandmeasuringtechnologycoupledwithHSCCCforhigh-speedcountercurrentchromatography(HSCCC)。TheapplicationofHSCCCisalsointroduced.Atlast,thisarticlediscussestheexpectationofHSCCC.Keywords:High-speedcountercurrentchromatography(HSCCC);Two-phasesolventsystems;Separation;Checkingandmeasuring;Application在互不相溶的溶剂中溶质可以有不同的分配系数,根据此原理,产生了逆流色谱技术。逆流色谱从产生至今,经过不断的发展与完善,逆流色谱技术和设备都已趋近于成熟。至今,已出现了高速逆流色谱技术(high-speedcountercurrentchromatography,HSCCC),它是逆流色谱技术经历了近60年发展的结果。高速逆流色谱技术(HSCCC)最早的研制应用者是美国国立卫生院Ito博士[1],最初它是用来进行制备分离的。近几年,人们对健康的认识越来越深刻,更多的人追求天然绿色的健康理念,故HSCCC作为一种对提取物污染小的制备技术,它的应用越来越受到了人们的关注。目前,HSCCC已从制备型发展到了分析型,甚至是微量分析型,应用范围也十分广泛[2]。高速逆流色谱技术在我国的应用较早,技术水平在国际领域也处于领先地位。目前,我国是世界上为数不多的高速逆流色谱仪生产国之一。我国的深圳同田生化技术有限公司是全球第一家多分离柱高速逆流色谱仪专业生产企业。公司拥有自主知识产权的高速逆流色谱专利技术,现已研制并生产出TBE系列分析型,半制备型TBE-300、300A,制备型TBE-1000高速逆流色谱仪设备。本文就高速逆流色谱技术的原理及特点、溶剂体系的选择、影响提取效果的因素、与之相联的检测技术以及其应用现状,做简单的综述。1原理及特点—————————基金项目:广东佛山市科技局攻关项目(03080011),陕西科技大学B类科研创新团队资助。作者简介:刘迪(1980-),女,陕西科技大学生命科学与工程学院在读研究生。E-mail:didi19801210@126.com收稿日期:2005-12-211.1原理流体动力学中有一种特殊的动力学平衡现象,即单向流体动力学平衡现象。HSCCC就是利用了这种现象来实现高速分离的。在这样的动力平衡体系中,两种互不混溶的溶剂相在转动螺旋管中单向地分布。高速逆流色谱仪工作时,色谱仪中的螺旋管做行星运动,由于重力及螺旋管力的作用,固定相移向螺旋管的入端,使得固定相得以保留,同时两相溶剂在螺旋管中得以混合。由于不同溶质在两相中的分配系数不同,溶质在两相溶剂中进行分配平衡,从而使不同成分得以分离。1.2特点高速逆流色谱技术的特点有以下几点:(1)操作简单易行:传统的制备方法,如重结晶、柱层析和高效液相色谱(制备型),操作周期长且步骤繁琐。HSCCC无需对样品进行复杂的处理,出峰可以在线检测,且可以和灵敏度高的检测技术联用,方便快捷准确。(2)应用范围很广:HSCCC中使用的两相溶剂体系组成可以是任意的,故可以适用于各种化合物的分离。(3)无需固体载体:由于不使用固体载体所以不会出现吸附、污染、峰形拖尾以及样品损失等现象。因此HSCCC在经过多次重复分离均可以实现较好的重现性以及得到较高的回收率。(4)产品纯度高:选择正确的溶剂体系,可以将样品分离后得到高于90%纯度的产品。(5)适用于制备型分离。2溶剂体系的选择欲用HSCCC进行成功的分离,选择适宜的溶剂系统非常重要。不同的溶剂系统,具有不同的上、下相之比,其粘度、极性、密度等性质相差甚远,对相同的成分具有不同的溶解、分配能力,形成分配系数的差异,对分离效果产生不同的影响。目前,溶剂体系的选择还没有一套完整的理论依据。一般来讲,选择的条件为[3]:(1)溶剂可分层;(2)不造成样品的分解或变性;(3)固定相能实现足够高的保留值:一般要求固定相的保留值大于50%(体积比);(4)样品在溶剂系统中有合适的分配系数值:被分离物质的分配系数(K)范围要在0.5~2(K=Cu/CL,Cu是上相中溶质浓度,CL是下相中溶质浓度),测量K值可以用浓度测定法和色谱法(TLC或HPLC);(5)溶剂易挥发除去。对于未知组成的样品,一般根据经验来选择溶剂体系。通常是先选用氯仿/甲醇/水(2:1:1,体积比,下同)或正己烷/乙酸乙酯/甲醇/水(1∶1∶1∶1)溶剂体系进行尝试,然后再进行适当的改变。溶剂体系选择后,通常以平衡两相中的上相为固定相,下相为流动相。另外,两相中的酸碱性不同,会对溶液中酸碱性较敏感的化学成分的分离造成影响。近年来,溶剂体系的选择已经发展到用超临界CO2(SFCO2)以及制冷剂R134a(1,1,1,2-四氟乙烯)作流动相[4]。3影响因素高速逆流色谱仪的转速、流动相流速、进样体积是影响提取效果的主要因素。通常情况下:(1)转速越高,越易产生乳化现象;(2)流动相流速越大,固定相流失加重;(3)进样量太大,峰间距变窄,峰形变宽。在选定了溶剂体系后,有时需要对三个仪器运行参数(转速,流动相流速,进样体积)进行正交试验,以确定最佳分离条件。4与高速逆流色谱技术相联的检测技术目前,可见光检测﹑紫外光检测技术在HSCCC中应用较多。但有时由于组分对可见光或紫外光无吸收,或是固定相的流失导致流出液乳化,故无法用常用光学检测器检测。现在已出现了HSCCC与质谱(MS)、电子电离质谱(EIMS)、化学电离质谱(CIMS)、快速原子轰击质谱(FABMS)、热喷雾质谱(TSPMS)和电喷雾质谱(ESIMS)的联用[5]。5进展5.1天然产物HSCCC具有较强的适应性,可以从复杂的天然产物粗制品中提取不同特性(如不同极性)的有效成分。用乙酸乙酯/正己烷/甲醇/水(3∶1∶1∶6)分离红茶粗提物,得到茶黄素、茶黄素单没食子酸酯和茶黄素双没食子酸酯[6];用氯仿/甲醇/水(4∶3∶2)分离银杏叶粗提物,得到白果内酯[7];先用乙酸乙酯/正丁醇/水(5:1.8:6)分离山茱萸粗提物,再用乙酸乙酯/乙醇/水(5:0.5:6)进一步分离,得到纯度为97%的没食子酸[8];用石油醚/乙酸乙酯/甲醇/水(1:3:2:2)分离含82.89%二氢杨梅素的蛇葡萄粗提物,得到纯度为90%以上的二氢杨梅素[9];用氯仿/甲醇/水(4∶3.8∶2)分离芦荟粗提物,可以将芦荟中的蒽醌类成分很好的分离[10]HSCCC不仅可以用来对天然产物的粗提物进行有效成分的提纯,还可以用于对天然产物进行除杂处理。5.2中药我国是中药大国,中药在我国的资源十分丰富。基于HSCCC的特点,利用它来进行中药有效成分的提取与纯化,具有很大优势。用丁醇/乙酸/水(4:1:5)分离冬忍花粗提物中的绿原酸,粗提物绿原酸含量为5.97%,纯化后纯度达到94.8%,得率达到了约90%[11];用正己烷/正丁醇/水(3:4:7)分离人参粗提物,可以得到5种组分[12];用正己烷/乙醛/乙醇/水分离紫草粗提物,可以得到纯度为98.9%的紫草宁,回收率达到96.95%[13];用氯仿/甲醇/异丙醇/水(5:6:1:4)分离刺五加粗品,得到刺五加苷,纯度为98%[14];用分析型的HSCCC设备得出用氯仿/甲醇/0.2M盐酸(4:1.5:2)可以从黄连中分离出4种生物碱,并用制备型设备进行分离制备[15];用氯仿/甲醇/0.5mol/LHCl(2:1:1)分离中药黄柏粗提物,可以得到8种生物碱和一种小檗碱[16];用氯仿/甲醇/水(4:3:2)分离虎杖粗提物中的乙酸乙酯相,用乙酸乙酯/乙醇/水(10:1:10)和乙酸乙酯/乙醇/水(70:1:70)分离虎杖粗提物中的水相,最后得到白藜芦醇和白藜芦醇甙,纯度均为99%[17];用pH6.2的氯仿/磷酸-磷酸钠缓冲液(1∶1)分离苦参粗提物得到生物碱类成分[18];用正己烷/乙醇/水(10∶5.5∶4.5)和正己烷/乙醇/水(10∶7∶3),采用分步洗脱的方法可以分离纯化丹参[19];采用乙酸乙酯/甲醇/水(4∶1∶5)分离长瓣金莲花粗提物,得到黄酮类物质[20];采用甲醇/NaH2PO4缓冲液(4∶3∶1)分离弥勒獐牙菜中的总生物碱,并证实了其中有一种为龙宁胆碱[21];用氯仿/甲醇/NaH2PO4缓冲溶液(pH值4.8)(3∶2.5∶1)分离青叶胆中的生物碱,并证实了其中一个生物碱为龙胆碱,含量30%[22];用氯仿/甲醇/水(10∶7∶3)分离纯化雪莲黄酮类成分[23];用氯仿/甲醇/水(9∶10.5∶8)从芦荟生药中一次性分离得到芦荟甙(纯度99.99%)和芦荟大黄素(纯度95.83%)[24];用氯仿∶甲醇∶水=4∶(3.5~4.0)∶2作为溶剂分离系统,对含蒽醌类中草药的乙醇粗提物进行分离,该溶剂体系具有通用性,用它来分离茜草、虎杖及决明子中的蒽醌类活性成分[25]。有实验研究表明,HSCCC是制订中药指纹图谱的一种可行的方法[26]。中药中的活性成分因产地、气候和生长阶段的不同而有所不同。因此,有必要建立中药指纹图谱对中药的质量进行监控。利用分析型的HSCCC,将不同种类的中药成分经过HSCCC分离,可以得到精密度较高的指纹图谱。同一品种中药的HSCCC图谱峰的个数一致,而且对应峰为同一组分,这是利用HSCCC建立指纹图谱的基础。通过大量成熟的研究,整理出中药材一系列的特征峰和色谱指纹,可以为我国中药的质量控制提供一种新方法和新标准。5.3食品利用HSCCC进样量大的特点,可以在食品研究中实现功能性成分的制备分离和食品的除毒去杂。用非水体系正己烷/二氯甲烷/乙腈(10:3.5:6.5)分离番茄粗提物中的番茄红素,可以从番茄红素含量为9%的粗提物中得到纯度超过98.5%的纯品[27];用庚烷/乙腈/乙酸/甲醇(4:5:1:1)分离葡萄籽的超临界萃取物,得到γ-亚油酸、亚油酸、棕榈酸、油酸、硬脂酸,各成分纯度均超过95%,其中亚油酸纯度高达99%[28];用庚烷/乙腈/乙酸乙酯(5∶5∶1)分离混合植物甾醇标准品,一次性分离可得到质量分数为97%的β-谷甾醇和质量分数为91%的菜油甾醇产品,收率分别可达56%和50%[29];用乙酸乙酯/醋酸/水(5:1:10)分离大豆粗提物,得到大豆苷和染料木苷,纯度分别达到98.2%和99.2%[30];用叔丁基甲基醚/正丁醇/乙腈/水(2:2:1:5)分离虫胶,可以得到A、B、C、E4种乳酸,经HPLC鉴定纯度分别达到97.2%
本文标题:高速逆流色谱技术应用现状
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