细胞凋亡检测

第十三章细胞凋亡检测细胞凋亡的几种检测方法形态学观察：普通光镜、荧光显微镜、透射电子显微镜磷脂酰丝氨酸外翻分析（AnnexinV法）线粒体膜势能的检测DNA片断化检测：大分子染色体DNA片段、DNALadder脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（terminal-deoxynucleotidyltransferasemediatednickendlabeling,TUNEL）半胱氨酸蛋白酶Caspase家族活性的检测细胞体积缩小，连接消失，与周围的细胞脱离，然后是细胞质密度增加，核质浓缩，核膜核仁破碎，胞膜有小泡状形成，膜内侧磷脂酰丝氨酸外翻到膜表面，胞膜结构仍然完整，最终可将凋亡细胞遗骸分割包裹为几个凋亡小体。形态学观察光学显微镜和倒置显微镜：体积缩小、核深染、核碎裂、凋亡小体形成、无炎症反应荧光显微镜和激光共聚焦显微镜：DNA特异性染料（Hoechest33342/33258,DAPI）透射电子显微镜：超微结构是诊断凋亡的最可靠指标电镜下：凋亡的细胞皱缩，质膜完整，胞浆致密，细胞器密集，不同程度退变；核染色质致密，形成形状不一，大小不等的团块边集于核膜处，进而胞核裂解；胞浆发生芽突。胞浆芽突脱落后，形成许多凋亡小体。AnnexinV法磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine，PS）：细胞凋亡早期从内侧翻转到细胞膜表面AnnexinV:钙依赖性的磷脂结合蛋白，与PS可高亲和力特异性结合.由于PS外膜化比凋亡引起的核酸变化更早，所以该试剂盒比DNA检测法能更早期检测细胞凋亡AnnexinV与PI联合碘化丙啶(propidineiodide,PI)是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞，PI能够透过细胞膜而使细胞核红染。因此将Annexin-V与PI匹配使用，可检测早晚期的凋亡细胞。已开发出多种荧光标记的试剂盒流式细胞仪分析荧光显微镜结果DNA片断化检测细胞凋亡时主要的生化特征是其染色质发生浓缩,染色质DNA在核小体单位之间的连接处断裂,形成50~300kb长的DNA大片段,或180~200bp整数倍的寡核苷酸片段,在凝胶电泳上表现为梯形电泳图谱(DNAladder)。(1)本方法不能检测单个细胞水平的凋亡。(2)不能提供细胞发生凋亡所处的组织位置和细胞分化状态。TdT介导的dUTP缺口末端标记技术(TUNEL)细胞凋亡中,染色体DNA双链断裂或单链断裂而产生大量的粘性3’-OH末端，可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）的作用下，将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸酶或生物素形成的衍生物标记到DNA的3’-末端，从而可进行凋亡细胞的检测是分子生物学与形态学相结合的研究方法，对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色，能准确地反应细胞凋亡典型的生物化学和形态特征Caspase活性的检测在正常状态下，Caspase家族都以无活性的酶原(30～50kD)形式表达，当细胞发生凋亡时Caspase可以被蛋白酶裂解，大亚基和小亚基形成活化的Caspase。一些Caspase活化后可以次序激活其他Caspase形成Caspase级联反应，促发细胞凋亡。在目前已知的14种Caspase中，Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9与凋亡的关系最为密切，在细胞凋亡中起执行凋亡的作用。相关基因表达的检测细胞凋亡时许多基因表达异常，检测这些凋亡相关调控基因的表达水平也成为检测细胞凋亡的常用方法Fas；c-myc；Bcl-2和bcl-X表达水平比例方法：Northern杂交、PCR、WesternBlot、免疫组化Amplifluor™ApoptosisGeneSystems：检测fas,bax-alpha和bcl-X(长的)基因的mRNA表达水平流式细胞仪对细胞凋亡的分析线粒体功能AnnexinVAssayCaspasesDNAFragmentationAssaysDNACycle优缺点：速度快、定量、收集大量数据、多参数测量；分选；从细胞整体上测量，不能定位凋亡检测方法的选择每种检测方法均有其优缺点，应对其原理有所了解根据自己的研究目的、样本种类选择合适的方法一般选择两种以上不同检测方法针对不同检测方法已开发出多种商业试剂盒，简化了实验步骤和操作程序