细胞凋亡及其检测方法

细胞凋亡及其检测方法1885年Flemming——退行性卵泡上皮细胞的染色质聚集成半月状或固缩成小体状；1886年Nissen——在哺乳期乳腺中观察到类似改变；1949年Hamberger——鸡胚背根神经节早期发育阶段有大量的细胞死亡；1972年Kerr——生理条件下的细胞死亡，有其特征性的表现；SydneyBrenner西德尼•布伦纳JohnSulston约翰•E•苏尔斯顿H.RobertHorvitzH.罗伯特•霍维茨研究细胞凋亡的意义有助于理解健康与疾病、生命与死亡；有助于理解一些病毒和细菌侵袭人体细胞的机理；（神经变性性疾病、中风、心肌梗塞和自身免疫疾病）有助于疾病的防治——激活或抑制细胞“自杀程序”；控制细胞凋亡的信号通道的正常与异常机理重大挑战王晓东教授主要研究成果集中在对于哺乳动物细胞凋亡的生化调控机制和信号通路的研究。2004年4月21日当选为美国科学院最年轻的院士。教学目的1、掌握细胞凋亡的特征。2、通过对细胞凋亡检测方法的学习，能结合本专业完成研究细胞凋亡的实验设计。细胞凋亡的定义细胞凋亡(Apoptosis)是指在一定生理或病理条件下，遵循自身的程序，启动一系列死亡基因的表达，引起内源性核酸内切酶和蛋白裂解酶的合成，导致DNA裂解乃至细胞的主动死亡。细胞程序性死亡（ProgrammedCellDeathPCD）细胞凋亡的诱因1细胞凋亡的抑制因素细胞凋亡的特征性变化—形态学核的变化----染色质凝聚，核碎片形成(续)形态学变化胞质的变化胞质浓缩（70%）细胞器的变化–线粒体（变化不明显；个别线粒体增大、增殖、空泡化）–内质网（网腔扩大、提供包裹膜）–细胞骨架（肌球蛋白、肌凝蛋白表达下调）细胞膜的变化Zeiosis（泡化）生物大分子丢失新出现生物大分子（phosphatidylserine）凋亡小体的形成（ApoptosisBody）凋亡过程中，核膜逐渐曲折变形、核仁裂解，随后胞膜内陷，整个细胞被分割为数个大小不等的有膜包裹的、内涵物不外泻的不连续小体，其内部可有一部分细胞器及核，该小体叫做凋亡小体。细胞凋亡的特征性变化—生物化学（一）DNALadder最突出的生化改变是染色质DNA的有控裂解。细胞发生凋亡时，细胞核内DNaseⅠ、DNaseⅡ在核小体间将染色质切为180-200bp或其整数倍的寡核苷酸片断，琼脂糖凝胶电泳分离裂解后的DNA图谱呈梯状，即梯状DNA。细胞坏死时DNA随意裂解为长度不一的片断，琼脂糖凝胶电泳呈“弥散状(smear)”.细胞凋亡的特征性变化—生物化学（二）多种蛋白酶的产生caspase蛋白酶（特异性酶切天冬氨酸氨基位点的半胱氨酸蛋白酶CysteinylAspartateSpecificProteinase）均以休眠状态的酶原形式存在于正常细胞中;都具有相似的催化部位，包括一个含有活性位点Cys残基的保守的QACRG基元和一个含His残基的SHG基元;具有自身活化和/或相互激活的能力;粒酶（granzyme）--免疫细胞释放的丝氨酸蛋白酶Calpain;细胞凋亡的特征性变化—生物化学（三）胞浆Ca2+的变化–1、胞内Ca2+库释放，胞外Ca2+内流促使胞浆Ca2+持续升高以信号转导方式、激活蛋白酶方式、激活核酸内切酶方式、激活转谷氨酰胺酶（transglutaminase）方式启动细胞凋亡；–2、Ca2+的释放打破了细胞内结构的稳定，使得细胞凋亡效应系统的关键成分与细胞结构正常时不能接触到的基质接触，从而触发细胞凋亡。（四）胞浆pH值的变化–1、胞浆酸化主要通过激活酸性DNaseⅡ启动细胞凋亡；–2、[pH]i降低也增强了一些酸性蛋白质功能，如转谷氨酰胺酶、酸性鞘磷脂酶；–3、减弱细胞的呼吸爆发作用，生成与细胞凋亡相关的活性氧（reactiveoxygenspecies,ROS）。–4、胞浆碱化可激活碱性核酸内切酶启动细胞凋亡。细胞凋亡时线粒体的变化1、细胞凋亡时，线粒体呼吸链受损，使细胞生成ATP减少，导致细胞死亡；2、线粒体产生的ROS增多，促进了细胞凋亡；3、线粒体膜电位受损影响其功能，导致细胞凋亡；4、线粒体渗透性转换孔（mtPTP）开放。细胞凋亡与坏死的区别细胞凋亡细胞坏死单细胞丢失细胞成群丢失细胞膜发泡但仍完整细胞膜不完整溶酶体完整溶酶体裂解染色质均一凝集染色质聚集成密度不均匀的团块染色质非随机降解为DNALadder染色质DNA被随机降解有新基因的转录没有新基因的转录受大分子的合成和激活过程的严格调控不需要核酸和蛋白质的合成离子稳态调节丧失不发生炎症反应发生严重的炎症反应细胞膜内陷形成凋亡小体，被临近正常细胞或巨噬细胞吞噬细胞肿胀、溶解，被巨噬细胞吞噬主动的、需要能量的过程不需要能量细胞凋亡的基本过程信号始动阶段：细胞膜表面特定受体可识别细胞死亡的胞外信号并激活第二信使、激酶，始动凋亡；凋亡信号的传导：P53、FADD、TRADD等介导凋亡信号的传导；调控阶段：由Bcl-2蛋白家族、细胞色素C及Caspase蛋白酶三个效应器参与调控；细胞凋亡的执行阶段：细胞结构发生改变，呈现细胞凋亡形态学变化。细胞凋亡信号转导分子1、Fas/FasL系统，TNFα/TNFαR系统；2、FADD（Fas-associatingproteinwithdeathdomain），TRADD（TNFR1-associateddeathdomainprotein）；3、Bcl-2蛋白家族；4、细胞色素C及Caspase蛋白酶；5、P53Bcl-2家族家族成员聚合体形式抑制凋亡bcl-2Bcl-2/Bcl-2、Bcl-2/Baxbcl-XLBcl-XL/Bcl-XL、Bcl-XL/Bcl-2mcl-1Mcl-1/Bcl-2、Mcl-1/Bcl-XL促进凋亡baxBax/Bax、Bax/Bcl-XLbcl-XsBcl-Xs/Bcl-XL、Bcl-Xs/Bcl-2badBad/Bcl-2、Bad/Bcl-XLbakBak/Bcl-XL(apoptosisinducingfactor)Bcl-2抑制凋亡的可能机制抑制细胞质膜脂质过氧化物的形成，从而阻止氧化应激导致的细胞凋亡。调节线粒体通透性。降低由凋亡因子诱导的线粒体膜通透性的增加；增加线粒体摄取Ca2+的作用，提高线粒体对Ca2+诱导呼吸链损伤的耐受力。抑制线粒体释放细胞色素C。抑制Caspase-3蛋白酶的活化。IAPInhibitorofapoptosisProteins神经细胞凋亡的研究模型1、从胚胎发育第21天大鼠分离获得交感神经元，在外与NGF持续共同培养7d，然后加入抗NGF抗体，封闭NGF；2、去神经营养因子诱导神经细胞凋亡；3、去血清诱导细胞凋亡；4、低氧神经元凋亡模型；5、低钾神经元凋亡模型;6、各种凋亡诱导剂诱导的体内凋亡模型；7、副交感神经元、运动神经元去轴突凋亡模型。MorphologicalChangesofAstrocytesunderIschemia:0hr:2hr:4hr:6hr:8hr神经细胞凋亡的检测方法根据凋亡的形态学特征、细胞凋亡的生化特征进行检测以及利用流式细胞仪进行检测。形态学是鉴定细胞凋亡最可靠的方法，主要是通过光学显微镜和电子显微镜，对组织或细胞进行各种染色。研究方法的分类一、根据方法的定性和定量特性分类(一)只能定性的方法常规琼脂糖凝胶电泳、形态学观察（普通光学显微镜、透射电镜、荧光显微镜）。(二)能进行定量或半定量的方法各种流式细胞仪方法、原位末端标记法、ELISA、定量琼脂糖凝胶电泳。（续）研究方法的选择二、根据是否能将凋亡和坏死区分开1、不能将凋亡和坏死区分开原位末端标记法，PI单染色法等。2、将凋亡和坏死区分开琼脂糖凝胶电泳，形态学观察（特别是透射电镜是区别凋亡和坏死最可靠的方法），Hoechst33342/PI双染色法流式细胞仪检测，AnnexinV/PI双染色法流式细胞仪检测等。三、根据样本来源不同选用不同的方法1、组织对活检组织或手术标本主要用形态学的方法如HE染色，透射电镜，还可以进行石蜡包埋组织切片行原位末端标记。也可作ELISA和将组织碾碎消化作琼脂糖凝胶电泳。2、培养细胞对细胞株或原代培养的细胞几乎所有的方法都可用。（续）研究方法的选择细胞凋亡的检测方法普通光学显微镜观察方法透射电子显微镜观察方法荧光显微镜观察方法琼脂糖凝胶电泳原位末端标记技术流式细胞仪染色法(ElectronMicrograph)AstrocytesunderIschemia早期：核染色体发生边集、固缩，电子密度增强，核形不规整，核膜表面凹凸不平；核发生碎裂，在细胞浆内可见多个电子密度增强的核碎片；细胞体积变小，胞浆浓缩，空泡增多；晚期：可见膜包裹的内有较完整的细胞器和细胞核碎片的凋亡小体。常规琼脂糖凝胶电泳检测DNALadder检测细胞凋亡时染色体从核小体间裂断形成由大约为180--200bp或其多聚体组成的寡核苷酸片段。提取DNA片段，UV灯下观察可见特征性的“梯状(ladder)”带。缺点:敏感性不高，且不能定量常规步骤收集细胞，PBS漂洗1次，2000r/min离心5min，弃上清。在1.5ml微量离心管中，离心收集细胞，弃上清。加入TE缓冲液400μl，悬浮细胞；缓漫加入1%SDS溶液20μl，摇匀。加入RNase(200μg/ml)42μl混匀，终浓度为20ug/ml，37℃，60min。加蛋白酶K溶液21μl至终浓度为100μg/ml，混匀，于50℃温育3h。冷却至室温，然后加入等体积的饱和酚抽提DNA，混匀后10,000r/min离心10min。吸取上清至另一EP管，加1/2体积氯仿：异戊醇抽提，混匀后10,000r/min离心10min。取上清至另一EP管，加等体积氯仿：异戊醇再抽提一次，10,000r/min离心10min.取上清至另一EP管，加1/10体积的5mol/L乙酸钾和2倍体积预冷的无水乙醇，充分混匀，可见絮状白色沉淀物，置于-20℃沉淀过夜。12,000r/min离心10min沉淀DNA，弃上清，加1ml75%乙醇洗沉淀的DNA，12,000r/min离心10min，充去上清液。置室温待乙醇挥发尽之后，加20μlTE缓冲液轻轻摇动溶解。取20μl样本，加4μl上样缓冲液，立即加到含溴化乙锭的1.5%琼脂糖凝胶的样品孔中，于1×TAE缓冲液中电泳(电压60V)1.5-2h，紫外透照仪下观察结果，拍照存档。琼脂糖凝胶电泳的定量检测将放射性同位素32P标记在经提取的寡小体片段5’末端，用X光片通过放射自显影成象，并用特定的设备分析计算进行定量研究。优点:灵敏度极高，是常规琼脂糖凝胶电泳的1000--2000倍；能定量；常规步骤(1)DNA提取同常规琼脂糖凝胶电泳法。(2)在0.5mlEppondorf管中加入下列反应体系：细胞DNA0.5-1.0μg10×缓冲液2μl32P-dATP（或32P-dCTP）0.5μCiKlenow聚合酶5U双蒸水加至20μl(3)混匀后10000r/min离心数秒，置室温中反应30min。(4)加入1μl0.5mol/LEDTA终止反应。(5)常规酚/氯仿/异戊醇抽提1次，无水乙醇沉淀DNA，室温干燥。(6)加入20μlTE缓冲液溶解DNA。(7)取标记DNA20μl加上样缓冲液4μl，混匀后加样于1.8%琼脂糖凝胶，50V电泳约2h。(8)电泳后的凝胶置滤纸上烘干，进地放射自显影。原位末端标记技术原位末端标记(insituend-labeling,ISEL)是将渗入到凋亡细胞中的外源性核苷酸在酶的催化下与凋亡细胞因内源性核酸酶的激活而产生的单股或双股断链相结合，再通过一定的显示系统使之显示出来。催化酶–末端脱氧核苷酸转移酶(terminaldeoxynucleotidyltransferase,TdT)–DNA聚合酶I常用原位末端标记技术1.末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）介导的d