36荧光光谱分析讲义03

理解分子荧光分析的基本原理理解激发光谱发射光谱同步光谱三维荧光光谱的含义掌握分子荧光发射光谱的特性了解荧光光谱仪器的组成及各部分作用掌握影响荧光强度的内部结构因素和外部环境因素了解光谱分析法的应用范围第一章分子荧光光谱分析1概述分子荧光光谱分析也叫荧光分光光度法，是当前普遍使用并有发展前途的一种光谱分析技术。物质的分子吸收了紫外和可见光后它的电子跃迁到激发态，然后以热能的形式将这一部分能量释放出来，本身回复到基态。。如果吸收辐射能后处于电子激发态的分子以发射辐射的方式释放这一部分能量，再发射的波长可以同分子所吸收的波长相同也可以不同，这个现象叫光致发光，最常见的光致发光现象是荧光和磷光。当用一种波长的光照射某种物质时，这个物质会在极短的时间内发射出比照射波长更长的光，这种光称为荧光。对于荧光来说，当激发光停止照射后，发光过程几乎立即（10-9-10-6S）停止;当用一种波长的光照射某种物质时，这如果种物质在较长的时间内发射出比照射波长更长的光，这种光称为磷光。对于磷光来说，当激发光停止照射后，发光过程将持续一段时间（10-1-10S）;磷光和荧光的发光机理是不同的。由于物质分子结构不同，所吸收的光的波长和发射的荧光波长也有所不同，利用这个特性可以定性鉴别物质。同一种分子结构的物质用同一波长的激发光照射可以发射相同波长的荧光，若该物质的浓度不同，则浓度大时，所发射的荧光强度也强，利用这个性质可以进行定量测定。用荧光进行定性和定量的方法叫荧光分析法。2荧光分析的原理2.1分子荧光发生过程2.1.1荧光与磷光2.1.1.1分子的电子能级与激发过程分子除了电子不断运动外，分子本身还有振动和转动。量子力学表明，这些运动的能量是量子化的，所以分子有电子能级，分子振动能级，及分子转动能级。每个电子能级中有包含一系列的振动能级和转动能级。..图1分子电子能级，振动能级和转动能级示意图室温下大多数分子处于基态的最低振动能级。处于基态的分子吸收能量（电能，热能，光能，化学能）后被激发为激发态。激发态不稳定将很快衰变为基态，若返回到基态伴随着光子的辐射，这种现象称为发光。现在从分子结构上讨论荧光发光产生的机理。每个分子具有一系列严格分立的能级，称为电子能级。而每个电子能级中又包含者一系列振动能级和转动能级。我们用S0S1Sn表示电子的基态，第一电子激发的单线态和第N电子激发的单线态。T1表示第一电子激发的三线态。电子激发的单线态和相应的三线态的区别在于电子自旋方向不同，另外三线态的能级稍微低一些。电子能态的的多重性用M=2S+1表示,S为电子自旋量子数的代数和，其数值为0或1。大多数分子含有偶数个电子。基态时这些电子成对地填充在能量最低的各个轨道中。根据Pauli不相容原理,一个给定轨道中的两个电子，必定具有相反方向的自旋，即自旋量子数分别为1/2和-1/2，其总自旋量子数S=0，就是说基态没有净自旋。分子的多重度M=1，该分子体系便处于单线态，用符号S表示。大多数有机物分子的基态是处于单线态的。基态分子在吸收光能后其价电子从成键轨道或非成键轨道跃迁到高能量的反键轨道上，产生激发态分子，此为分子光吸收过程。但是激发态分子不稳定，通常很快失去能量回到基态。如果激发态分子在返回基态时以光辐射的形式失去能量，这种光辐射过程叫做光致发光。分子吸收能量后，如果电子在跃迁过程中不发生自旋方向的改变，这时分子处于激发的单线态。分子吸收能量后如果电子在跃迁过程中伴随自旋方向的改变，这时分子便具有两个自旋不配对的电子。即S=1，分子的多重度M=2*1+1=3，这时分子处于激发的三线态，用符号T表示。处于分立轨道上的非成对电子，平行自旋比成对自旋更稳定些（洪特规则）。因此三线态的能级总是比相应的单线态能级略低。单线基态激发单线态激发三线态图2单线态和三线态2.1.1.2荧光的产生根据波滋曼分布(Boltzmanndistribution)分子在室温时基本上处于电子能级的基态，当吸收了紫外可见光后，基态分子中的电子只能跃迁到激发单线态的各个不同振动-转动能级，根据自旋禁率,不能直接跃迁到激发三线态的振动-转动能级。处于激发态的分子是不稳定的，它可能通过辐射跃迁和无辐射跃迁等多种分子内去活化过程释放多余的能量而返回基态，发射荧光是其中途径之一。下面几种方式为基本去活化过程；振动弛豫：(VRvibrationalrelaxation)在溶液中的物质分子受入射光激发后形成的激发态分子，通过与溶剂分子碰撞，将部分能量传递给溶剂分子，其电子则返回同一电子激发态的最低振动能级。在这个过程中，分子被激发时吸收的能量不是以发出光辐射的形式耗散，因而属于无辐射跃迁。振动弛豫只能在同一电子能级进行，所需时间约为10-8秒数量级。内转换：(ICInternalconversion):指相同多重态电子能级中等能级间的一种无辐射跃迁过程。当两个电子激发态之间能量相差较小，以至其振动能级有重叠时，则可能发生电子由高能级以无辐射跃迁方式转移到低电子能级的激发态。上述的振动能级之间很接近时，内部能量转换容易发生。外转换（Ecexternalconversion）：溶液中激发态分子与溶剂分子及其他溶质分子之间发生碰撞而消耗能量，所消耗的能量转换为热能。外转换常发生在第一激发单线态或第一激发三线态的最低振动能级向基态转换的过程中。转换时间为10-9---10-7秒，其发生可以降低荧光强度，这一现象叫荧光熄灭或猝灭。系间跨越(Intersystemcrossing,ISC)：系间跨越指不同多重度状态之间的一种无辐射跃迁过程。它涉及到受激电子自旋状态的改变S1T1，使原来两个自旋配对的两个电子不再配对，这种跃迁是禁阻的，但如果两个电子的能级的振动能级有较大的重叠时，例如激发单线态S1的最低振动能级与激发三线态T1的较高振动能级重叠,则可能通过自旋-轨道耦合等作用使S1态转入T1态的某一振动能级.。系间跨越可以使荧光强度减弱或熄灭。荧光发射：（Fluorescenceemission）.当分子被激发到任意一个激发单线态，并通过内转换及振动弛豫返回到第一激发单线态的最低振动能级后，再以辐射形式发射光量子并返回到基态的各个不同的振动能级上，在这个过程中发射的光量子即称作荧光。由于从较高的激发态的振动能级返回到第一激发单线态的最低振动能级耗散了部分能量，荧光的能量小于激发光能量，所以发射荧光的波长比激发光的波长要长。发射荧光的过程约需10-9—10-7秒，电子返回到基态时可以停留在基态的任意振动能级上，因此得到的荧光谱线有时呈现几个互相靠近的峰。通过进一步振动弛豫，这些电子很快回到基态的最低振动能级。根据kasha规则，荧光多为S1S0跃迁。荧光产生的过程和条件：荧光物质产生荧光的过程可以分为4个步骤1处于基态最低振动能级的荧光物质分子受到紫外线的照射，吸收了和它所具有的特征频率相一致的光线，跃迁到第一电子激发态的各个振动能级；2被激发到第一电子激发态的各个振动能级的分子，通过无辐射跃迁，返回到第一电子激发态的最低振动能级；3返回到第一电子激发态的最低振动能级的分子继续降落到基态的各个不同振动能级，同时发射出相应的光量子，这就是荧光；4到达基态的各个不同振动能级的分子，再通过无辐射跃迁最后返回的基态的最低振动能级。磷光发射激发态分子通过振动弛豫下降到第一电子激发态的最低振动能级后，有可能经过体系间跨越转移到激发三线态的高振动能级上。从单线态到三线态的分子系间跨越跃迁发生后，接着发生快速的振动弛豫而达到三线态的最低振动能级上。分子在三线态的最低振动能级可以停留一段时间，然后发出光辐射跃迁至基态的各个振动能级，这种光辐射叫磷光。磷光与荧光的根本区别是荧光是由激发单线态最低振动能级至基态各振动能级间跃迁产生的。由于激发三线态的最低振动能级比激发单线态的最低振动能级能量低，故磷光辐射的能量比荧光更小，亦即磷光的波长比荧光更长。从紫外光照射到发射荧光的时间约为10–8秒～10–5秒，而发射磷光则更迟一些，约在照射后10–4秒～10秒。图2荧光的产生2.1.2分子荧光的激发光谱与发射光谱任何荧光化合物都有两个特征光谱：激发光谱和发射光谱，这是定性和定量分析的基本参数和依据。激发光谱：荧光是光致发光，因此必须选择合适的激发波长。这可由激发光谱曲线来确定。绘制激发光谱曲线时选择荧光的最大发射波长为测量波长，改变激发光的波长，测定荧光强度的变化。以激发光波长为横坐标，荧光强度为纵坐标作图，即可得到荧光化合物的激发光谱。激发光谱的形状与吸收光谱的形状极为相似，经校正后的真实激发光谱与吸收光谱不仅形状相同，而且波长位置也一样，这是因为物质分子吸收能量的过程就是激发过程。区别在于紫外吸收光谱测定对紫外光的的吸收度，而荧光激发光谱测定发射的荧光强度。发射光谱：简称荧光光谱。将激发光波长固定在最大激发波长处，然后扫描发射波长，测定不同发射波长处的荧光强度得到荧光发射光谱。图3是室温下蒽在环己烷溶液中荧光激发光谱和发射光谱。从图中可见在蒽的激发光谱中350nm激发峰处有几个小峰，这是由于吸收能量后由基态跃迁到第一电子激发态中各个不同振动能级引起的。在蒽的发射光谱中也有几个小峰，这是由于蒽分子从激发态中各个不同振动能级跃迁到基态中不同振动能级发射出的荧光量子的能量不同引起的。2.1.3荧光光谱的特征：2.1.3.1Stockes位移在溶液荧光光谱中观察到的荧光发射光波长总是大于激发光波长，Stockes1852年首先观察到这种波长移动现象，因而称之为Stockes位移。激发峰位和发射峰位的波长差称为Stockes位移，它表示分子回到基态之前，在激发态寿命期间的能量消耗。用公式表示如下：单位是cm-1Stockes位移=107(1/ex-1/em)exem分别为校正后的最大激发波长和发射波长。Stockes位移说明在激发和发射之间存在着一定能量损失，激发态分子通过内转换和振动驰豫过程迅速到达第一激发单线态的最低振动能级，这是产生Stockes位移的主要原因。激发态分子与溶剂分子的碰撞也造成能量损失，加大了Stockes位移。2.1.3.2荧光发射光谱的形状与激发波长无关原因：荧光分子吸收了不同波长的激发光后可被激发到不同能级，然后通过振动弛豫和内部能量转换,最终都将回到第一激发单线态的最低振动能级，再发射荧光。因此荧光发射与荧光物质的分子发射到哪个能级无关，即与激发能量无关。一般说来，荧光发射光谱的形状与激发波长的选择无关，激发电子都是从电子第一激发态的最低振动能级返回到基态的各个振动能级，所以荧光发射光谱的形状与激发波长无关。2.1.3.3荧光光谱与激发光谱的镜像关系荧光物质的荧光发射光谱与激发光谱存在着近似的“镜像对称”关系。图3是蒽的荧光激发和发射光谱图.。蒽的荧光激发光谱左边灰色图谱有一个a峰它是由分子吸收光后能后从基态S0跃迁到第二电子激发态S2形成的。在高分辨率的荧光光谱图上可以观察到B0b1、b2、b3、b4、等小峰组成的一蔟，他们分别由是由分子吸收光能后从基态S0跃迁到第一电子激发态S1的各个振动能级形成的（见光谱图上方与之对应的能级示意图）。各小峰间波长递减值与振动能级差有关，各个小峰的高度与跃迁几率有关（b1的跃迁几率最大，b0次之，b2、b3、b4依次递减。蒽的荧光发射光谱（右边黑色图谱）同样包含C0、C1、C2、C3、C4一蔟小峰,他们分别由分子从第一电子激发态S1的最低振动能级跃迁至基态S0的各个振动能级发出光辐射形成的。由于电子基态的振动能级分布与与激发态相似但不相同,b1峰与c1峰b2峰与c2峰都是以b2为中心基本对称。再加上C0、C1、C2、等峰的高度也与跃迁几率有关，c1的跃迁几率最大，c0次之，c2、c3、c4依次递减.）因此形成了激发光谱和荧光发射光谱的对称镜像现象。2.2荧光与分子结构的关系荧光与分子结构的关系是一个比较重要问题，弄清他们之间的关系可以预示分子能否发生荧光，在什麽条件下发生荧光。这对研究分子荧光分析的应用很有意义。2.2.1荧光寿命与荧光效率荧光寿命与荧光