第三章-酶催化反应动力学

1第三章酶催化反应动力学酶工程与蛋白质工程2本节主要内容一、酶催化反应动力学二、影响酶催化作用的因素三、酶活测定3动力学研究的主要目的酶催化动力学主要是研究酶催化反应的速率问题,定量研究各种因素对酶促反应速度的影响、酶促反应的规律及反应历程。建立可靠的总反应速率方程式，进而用于计算反应时间、最佳反应条件，合理设计反应器指导实际应用。本章重点讨论[S]对酶促反应速度的影响，并且介绍一些基本概念，和简单体系的动力学方程的推导。重点掌握米氏方程，抑制动力学，学会如何推导动力学方程，Km和Vmax的求取，物理意义。4基元反应知识复习5678一、酶催化反应动力学9在中间产物学说的基础上，Michaelis-Mentenequation著名的米氏方程，是酶反应机制的一个重要突破。一、酶催化反应动力学基本模型---米氏方程该方程称为该方程称为MichaelisMichaelis--MentenMenten方程（米氏方程），其中方程（米氏方程），其中KmKm值称之米氏常值称之米氏常数，数，VmaxVmax是酶被底物饱和时的反应速度。是酶被底物饱和时的反应速度。10简单的酶反应动力学—单底物酶催化动力学简单的酶催化反应动力学是指由一种反应物（底物）参与的不可逆反应。属于此类反应的有酶催化的水解反应和异构化反应。这种简单的单底物酶催化动力学，是酶反应动力学的基础。快速平衡学说稳态学说11121[]kkkSEESEP++−⎯⎯→+⎯⎯→+←⎯⎯1.快速平衡推导法根据中间产物学说和三条假设为基础推导得到。三条假设为：①第一步迅速平衡，第二步慢，为限速步骤，即k2k-1②[S][E]，[S][ES]；③酶以E和ES两种状态存在。121、快速平衡法—推导过程（1）基元反应质量作用定律（2）质量守恒原理（3）快速平衡121[]kkkSEESEP++−⎯⎯→+⎯⎯→+←⎯⎯（1）（2）（3）132.Briggs－Haldane修正方程1925年，Briggs和Haldane对米氏方程做了修正，提出稳态学说。鉴于许多酶有很大的催化能力，即当ES形成后，生成产物P和E的速度井不一定小于[ES]解离为S和E的速度，此时ES形成E+P这一步就不能忽略不计。他们认为，许多酶催化反应的k2很高，k2不仅不特小于k-1，而且远比k-1大，即ES分解成E和P的速度比解离成E和S的速度快。即ES的浓度很低。故该学说认为，在反应进行了一段很短的时间后，[ES]由0增加到一定数值，然后保持不变，即达到稳态水平，这时ES浓度也不变，其生成速度等于两向分解速度之和。拟稳态假设：CSCE中间复合物ES一经分解，产生的游离酶立即与底物结合，使中间复合物ES浓度保持衡定14拟稳态法—推导过程（1）基元反应质量作用定律（2）质量守恒原理（3）拟稳态假设（1）（2）（3）15平衡法和稳态法的区别Ks=11kk−Km=121kkk−+[][]smVSVkS=+[][]mmVSVKS=+E+SESE+Pk1k-1k2第一步是快速可逆的平衡k2k-1[S][E]，[S][ES]；[]dESdt=016米氏方程特征：反应速度与底物浓度之间的关系在低浓度底物情况下，反应相对于底物是一级反应，反应速度与底物成直线关系。当底物浓度处于中间范围时，相对于底物的反应是混合级反应。当底物浓度增加时，反应由一级反应向零级反应过渡。在高浓度底物下，酶被底物饱和，反应相对于底物是零级反应。反应速度与底物浓度无关。酶被底物饱和时的速度称之最大反应速度Vmax173.酶促反应动力学参数和应用KmVmaxKcat/Km18（1）米氏常数Km的意义1.Km物理含义：是指ES复合物消失速度（k-1+K+2）与形成速度（k+1）之比，其数值为酶促反应达到最大反应速度一半时的底物浓度2.km是酶的一个基本的特征常数。不同的酶具有不同Km值，其大小与酶的浓度无关，而与具体的底物有关，且随着温度、pH和离子强度而改变。酶的米氏常数一般是10-2—10-5mol/l191）鉴别酶的最适底物当k-1＞＞k2时，km的大小可以表示酶与底物的亲和性。Km值大，意味着酶和底物亲和力小，反之则大。对于一个专一性较低的酶，作用于多种底物时，各底物与该酶的Km值则有差异，具有最小的Km的底物就是该酶的最适底物或称天然底物。‡例如己糖激酶对葡萄糖的Km值为1.5×10-4；对果糖的Km值为1.5×10-3，显然酶对葡萄糖的亲和性更高，葡萄糖就称之为己糖激酶的天然底物。202）计算达到一定反应速率时所需的底物浓度。[S]v1000km0.999V100km0.99V10km0.91V3km0.75V1km0.50V0.33km0.25V0.10km0.091V21从米氏方程中求得：当反应速度达到最大反应速度的90%，则v=——————Vmax·[S]km+[S]90%V=100%V[S]/(km+[S])即[S]=9km在进行酶活力测定时，通常用4km的底物浓度即可。224）km还可以推断某一代谢物在体内可能的代谢途径。丙酮酸乳酸乙酰CoA乙醛乳酸脱氢酶（1.7×10-5）丙酮酸脱氢酶（1.3×10-3）丙酮酸脱羧酶（1.0×10-3）当丙酮酸浓度较低时，代谢走哪条途径决定于km最小的酶。3）催化可逆反应的酶，当正反应和逆反应Km值不同时，Km值小的底物所示的反应方向，应是该酶催化的优势方向。235）作为判断同工酶种类的依据：由于存在Km值不同而功能相同的酶，从而发现同工酶。葡萄糖激酶的发现就是因为它的Km值与己糖激酶的Km值相差极大，从而发现葡萄糖激酶。6）测定不同抑制剂对某个酶Km及Vmax的影响，可以区别该抑制剂是竞争性抑制剂还是非竞争性抑制剂。7）为了鉴定不同菌株来源的天冬酰胺酶对治疗白血病的疗效，可以测定不同菌株的天冬酰胺酶对天冬酰胺的Km值，从中选用Km值较小的酶，因此这不仅是评价药用酶的理论基础之一，也是选用药用酶来源的依据。24（2）Vmax和K2的意义与Km相似，同一种酶对不同底物的Vmax也不同。当[S]无限大时，这时的反应为假一级反应，k2是表观一级反应速度常数。若[E]T用活性中心当量表示，则k2它表示单位时间内每个酶分子或每一活性部位催化的反应次数，因此又称为酶的转换数（Turnovernumber）。在单底物反应中，且假设反应过程中只产生一个活性中间物时，k2也即为催化常数（Catalyticconstant），用kcat表示，其值越大，说明酶的催化效率越高，kcat数值一般在5～105min-1范围内。2526Kcat:反映的是一种酶被底物饱和时的酶性质。在低[S]下，Kcat则失去了意义。当[s]km，Kcat/Km是一个比较酶催化效率较好的一个动力学参数。（3）.Kcat/Km27ƒkcat/KM通常被看做酶的效率，Kcat越大或是Km越小，都使得Kcat/Km越大ƒ在生理条件下，大多数的酶不被底物所饱和，且底物浓度与Km相比要小的多。When[S]KM,theenzymeislargelyunboundand[E]≈[E]T（3）酶的催化效率:kcat/KM评价28zWhen[S]KM,kcat/KMistherateconstantfortheinteractionofEandS.zkcat/KMcanbeusedasameasureofcatalyticefficiency.•生理条件下许多反应的底物浓度是很低的。在底物浓度很低时，v=（Kcat/Km）[E][S]，即Kcat/Km是表观二级速度常数。•Kcat/Km称为酶的专一性常数，它不受非生产性结合与中间产物积累的影响，可以表示酶对相互竞争的几种底物的专一性。S+EE+Pkcat/KM29Chymotrypsinhasapreferenceforcleavingnexttobulky,hydrophobicsidechains.30Howefficientcananenzymebe?(Howhighcankcat/KMbe?)SubstitutingforKMgives•即小于酶和底物复合物生成的速度常数。它不是真实的微观速度常数，只有当反应的限速步骤是酶与底物的相互碰撞时，它才是真实的微观速度常数。扩散限制决定了速度常数的上限是108-109mol-1s-1，碳酸酐酶、磷酸丙糖异构酶、乙酰胆碱酯酶等都接近这一极限，说明他们的进化已经很完善。31324.Km和Vmax的求取双倒数作图法在计算机广泛应用之前，通常都是利用米氏方程的转换形式求出Km和Vmax值。常用的米氏方程转换形式是双倒数方程。将1/ν对1/[S]作图，可以获得一条直线。从直线与x轴的截距可以得到1/Km的绝对值；而1/Vmax是直线与y轴的截距。max[][]mVSVKS=+maxmax111[]mKVVSV=+3334二、影响酶催化作用的因素352.1底物浓度的影响底物浓度是决定酶催化反应速度的主要因素。在其他条件不变的情况下，酶催化反应速度与底物浓度的关系如图。362.2酶浓度的影响在底物浓度足够高的条件下，酶催化反应速度与酶浓度成正比，它们之间的关系可以用下式表示：372.3温度对反应速度的影响每一种酶的催化反应都有适宜的温度范围和最适温度。在适宜温度范围内，酶才能够进行催化反应；在最适温度条件下，酶的催化反应速度达到最大一方面：在其他条件相同的情况下，温度每升高10℃，化学反应速度增加1～2倍。另一方面：酶是生物大分子，当温度升高时，酶的活性会受到影响，甚至引起变性而丧失其催化活性。这两个方面综合的结果，在某一特定温度的条件下，酶催化反应速度达到最大，这就是最适温度。102030405060708090020406080100TemperatureOCRelativeActivity(%)38超过最适温度，反应速度逐步降低，一般酶在60℃以上容易变性失活。但也有一些酶的热稳定性较高，例如，聚合酶链反应中广泛使用的Taq聚合酶95℃仍然可以稳定地进行催化。耐高温α-淀粉酶在90℃甚至更高的温度条件下，仍然正常地发挥其催化功能。添加酶的作用底物或者某些稳定剂可以适当提高酶的热稳定性。392.4pH对酶反应速度的影响酶的催化作用与反应液的pH值有很大关系。每一种酶都有其各自的适宜pH值范围和最适pH值。只有在适宜pH值范围内，酶才能显示其催化活性。在最适pH值条件下，酶催化反应速度达到最大。pH值过高或过低，都可能引起酶的变性失活。因此，在酶催化反应过程中，必须控制好pH值。40葡萄糖-6-磷酸酶胃蛋白酶41酶底物等电点最适反应pHα－淀粉酶（猪胰）淀粉5.2～5.66.9β－淀粉酶（麦芽）淀粉6.05.2蔗糖酶蔗糖5.04.5乙酰胆碱酯酶乙酰胆碱5.08.4核糖核酸酶（牛胰）核糖核酸7.87.8胃蛋白酶各种蛋白质3.81.5～2.5胰蛋白酶各种蛋白质7.87.5胰凝乳蛋白酶各种蛋白质8.1～8.68～9木瓜蛋白酶各种蛋白质9.05.0～5.5菠萝蛋白酶各种蛋白质9.5～10.06.0～6.5脲酶尿素5.0～5.16.4～7.6脱羧酶（酵母）丙酮酸5.16.0过氧化氢酶（也叫触酶，牛肝）H2O25.65.7醛缩酶（兔肌）果糖二磷酸6.07.5～8.5己糖激酶（酵母）葡萄糖，ATP4.5～4.88～9黄嘌呤氧化酶（牛乳）黄嘌呤6.78.5～9.0一些酶的最适pH和等电点42酶分子中含有多种可解离的基团，如－COOH、－NH2、－OH、咪唑基、胍基等。酶的活性构象与酶分子中各基团的解离状态有关。当pH偏离最适pH时，活性中心基团的解离状态发生变化，使酶与底物的结合能力（亲和力）下降，催化能力也下降，致使酶活性下降，即保持正确解离状态的酶分子比例下降。若pH偏离得太多，导致构象发生不可逆变化，就会使酶变性失活。如溶菌酶活性中心的两个氨基酸只有处于Asp52-COO－和Glu35-COOH状态下才具有活性。底物的解离状态也受pH的影响，从而影响到底物与酶的结合及被催化反应。pH值影响酶的催化作用的原因432.5有抑制剂对酶反应动力学能够使酶的