2013

现代生物科技专题1.2基因工程的基本操作程序原核细胞的基因结构非编码区非编码区编码区编码区上游编码区下游与RNA聚合酶结合位点启动子终止子RNA聚合酶能够识别调控序列中的结合位点，并与其结合。转录开始后，RNA聚合酶沿DNA分子移动，并以DNA分子的一条链为模板合成RNA。转录完毕后，RNA链释放出来，紧接着RNA聚合酶也从DNA模板链上脱落下来。真核细胞的基因结构编码区非编码区非编码区与RNA聚合酶结合位点内含子外显子能够编码蛋白质的序列叫做外显子不能够编码蛋白质的序列叫做内含子启动子终止子编码区上游编码区下游内含子：外显子：非编码序列：包括非编码区和内含子启动子.VS.起始密码/终止子.VS./终止密码存在分子：作用：DNA(基因)启动/终止转录mRNA起始/终止翻译基因工程基本操作的四个步骤1、目的基因的获取2、基因表达载体的构建3、将目的基因导入受体细胞4、目的基因的检测与鉴定一、目的基因的获取B、获取目的基因的常用方法有哪些?（1）从基因文库中获取（2）利用PCR技术扩增（3）人工合成A、目的基因主要是指______________________编码蛋白质的结构基因未知序列已知序列(一)从基因文库中获取目的基因将含有某种生物不同基因的许多DNA片断，导入到受体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。基因文库基因组文库部分基因文库（如:cDNA文库）1.基因文库2.基因文库的构建方法鸟枪法：供体细胞中的DNA许多DNA片段运载体限制酶与载体连接载入受体细胞产生特定性状导入外源DNA扩增目的基因分离①(DNA文库构建)②cDNA文库的构建-----反转录法目的基因的mRNA杂交双链(单链RNA/单链DNA)单链DNA（cDNA)反转录酶核酸酶HDNA聚合酶双链DNA(目的基因)mRNARNA－DNA杂合双链单链DNA双链DNA鸟枪法得到的真核基因放在原核细胞中无法表达③根据已知的氨基酸序列合成DNA法：蛋白质的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列结构基因的核苷酸序列推测推测目的基因化学合成部分基因文库3从基因文库获取目的基因根据目的基因的有关信息，如：基因的已知核苷酸序列；基因的功能；基因在染色体上的位置；基因的转录产物mRNA；基因的表达产物蛋白质；……①概念：PCR全称为_______________，是一项在生物____复制___________的核酸合成技术③条件：_______________________、_______________、___________、___________.②原理：__________④方式：以_____方式扩增，即____（n为扩增循环的次数）⑤结果：聚合酶链式反应体外特定DNA片段DNA复制已知基因的核苷酸序列四种脱氧核苷酸一对引物DNA聚合酶指数2n使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增(二)利用PCR技术扩增目的基因5/3/G—GT—C3/5/G—AC—C5/3/引物ⅡG—G变性复性延伸1.目的基因DNA受热变性，解链；2.引物与单链互补结合；3.合成链在DNA聚合酶作用下进行延伸。5/3/A—G引物Ⅰ⑥过程：a、DNA变性（90℃-96℃）：双链DNA模板在热作用下，_____断裂，形成___________b、退火（复性25℃-65℃）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部________。c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，从引物的5′端→3′端延伸，合成与模板互补的________。氢键单链DNA双链DNA链细胞内复制.VS.PCR扩增DNA母链4种dNTPTaqDNA聚合酶引物（2个snDNA）温度控制1）模板：2）原料：3）酶：DNA母链4种dNTP解旋酶DNA聚合酶引物酶DNA连接酶DNA增殖4）特点:半保留复制边解旋边复制(不用DNA连接酶)半保留复制全解旋再复制(三)人工合成法•已知其序列DNA合成仪•已知其mRNA的序列反转录•已知其翻译产物的氨基酸序列蛋白质的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列结构基因的核苷酸序列推测推测化学合成目的基因质粒DNA分子限制酶处理一个切口两个黏性末端两个切口获得目的基因DNA连接酶重组DNA分子（重组质粒）同一种二基因表达载体的构建复制原点：载体复制的起点启动子：RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得蛋白质终止子：能终止mRNA的转录标记基因：为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因基因表达载体的组成：复制原点+目的基因+启动子+终止子+标记基因将真核基因（鸟枪法得到）与质粒结合时需要注意的问题？1目的基因必须由反转录法得到（原核生物没有剪切内含子的酶）2可能要人为地加入启动子三将目的基因导入受体细胞•常用的受体细胞：动植物细胞、大肠杆菌、土壤农杆菌、枯草杆菌等。•将目的基因导入受体细胞的原理：借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。转化——目的基因进入_________内，并且在受体细胞内维持_____和_____的过程受体细胞稳定表达方法导入植物细胞导入动物细胞导入微生物细胞农杆菌转化法基因枪法花粉管通道法——显微注射法——感受态细胞吸收DNA分子三将目的基因导入受体细胞四目的基因的检测与鉴定——检查是否成功检测—鉴定—①检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因②检测目的基因是否转录出了mRNA③检测目的基因是否翻译成蛋白质抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等方法——方法——方法——DNA分子杂交DNA—RNA分子杂交抗原-抗体杂交目的基因的表达和检测接种实验抗原－抗体杂交法DNA-RNA分子杂交法DNA分子杂交法受体是否具有转基因特征个体水平目的基因是否翻译目的基因是否转录目的基因是否导入分子水平方法检测对象1.下表关于基因工程中有关基因操作的名词及对应的内容，正确的组合是2、下列属于获取目的基因的方法的是()①利用mRNA反转录形成②从基因组文库中提取③从受体细胞中提取④利用PCR技术⑤利用DNA转录⑥人工合成A.①②③⑤B.①②⑤⑥C.①②③④D.①②④⑥随堂闯关随堂闯关3.细菌的质粒分子带有一个抗菌素抗性基因，该抗性基因在基因工程中的主要作用是A．提高受体细胞在自然环境中的耐药性B．有利于对目的基因是否导入进行检测C．增加质粒分子的分子量D．便于与外源基因连接4.有关基因工程的叙述正确的是A．限制酶只在获得目的基因时才用B．重组质粒的形成是在细胞内完成的C．质粒都可作为运载体D．蛋白质的结构可为合成目的基因提供资料•谢谢！2.微生物作受体细胞原因：将目的基因导入微生物细胞3.转化方法：大肠杆菌繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少处理细胞→细胞→表达载体与感受态细胞混合→_________细胞吸收DNA分子。Ca2+感受态感受态1.常用菌：目的基因插入Ti质粒的T-DNA上农杆菌导入植物细胞整合到受体细胞的染色体上目的基因的遗传特性得以维持稳定和表达1.农杆菌特点：易感染双子叶植物和裸子植物。Ti质粒的T-DNA可转移至受体细胞的染色体上2.转化适合双子叶植物和裸子植物重点：二次拼接二次导入.将目的基因导入动物细胞显微注射技术提纯基因表达载体体外显微注射入受精卵受精卵移植如果显示出杂交带，就表明待测样品含有目的基因或目的基因已经转录。适用于单子叶植物基因枪法胚珠花药花丝柱头花柱子房壁子房雄蕊雌蕊花粉管通道法适用于被子植物