2016现代组织化学技术-组织化学

现代组织化学技术华中科技大学同济医学院解剖学系组织胚胎学教研室李宏莲组织化学与细胞化学1.什么是组织化学与细胞化学技术？------介于细胞生物学、组织学、化学、生物化学、免疫学及分子生物学之间的边缘科学------对组织与细胞的化学成分或者酶活性进行定性、定位和定量的研究。常统称为“组织化学”------在保持组织或细胞基本不改变其生活状态时的微细结构的条件下，利用某些特异性的反应，采用显微镜技术观察某些化学成分或酶活性在组织或细胞内的定性、定位和定量及其变化规律Histochemistryandcytochemistry一、绪论2.组织化学与细胞化学技术的特点HE染色HE染色普通组织学技术：组织原位，染色，显微镜观察一、绪论组织原位，特异性的化学反应，显微镜观察——对组织或者细胞内特定物质进行定性，定位，定量分析组织化学与细胞化学技术铅法（ATP酶）2.组织化学与细胞化学技术的特点一、绪论PAS法显示粘多糖3.组织化学与细胞化学技术的主要类型(1)一般组织化学与细胞化学(2)免疫组织化学与细胞化学(3)原位杂交组织化学*每种均有光镜和电镜之分和定性与定量之分一、绪论化学方法，类化学方法，物理学方法，显微烧灰方法，免疫学方法，分子生物学方法等常用分类：4.组织化学与细胞化学技术的基本要求一、绪论(1)保持组织和细胞的完整性(2)被检物质具有不溶性和（或）可视性(3)反应具有特异性(4)反应具有灵敏性(5)可重复性1.取材（drawmaterial）(1)组织标本取材：准备充分、麻醉或处死方法合适、操作迅速、刀应锐利、适当清洗、离体即固定（或冷冻切片，或保存于-80℃冰箱）、大小适中（约2.5cm×2.5cm×0.2cm，宁可面积大，不能厚）(2)细胞标本取材：①涂片法：培养的悬浮细胞，人体液中的细胞等，细胞密度低时可先沉淀或者离心；②爬片法：贴壁生长的培养细胞；③印片法：活组织标本、尸检标本及子宫颈外口等脱落细胞二、标本的制备2.固定（fixation）(1)固定的目的：保持组织细胞原有的形态结构；使组织硬化；对组织化学及细胞化学技术来说---保存酶活性和蛋白质的抗原性非常重要(2)固定的优、缺点：优点：使组织细胞的形态结构得到保持缺点：拟检物质反应性减弱，酶的活性易受损二、标本的制备二、标本的制备2.固定(3)常用固定剂的种类及特点①单一固定剂：A.交联固定剂甲醛、多聚甲醛、戊二醛等：与蛋白多肽链氨基酸侧链的功能基团，如氨基、羟基、酰氨基等结合，使蛋白分子相互交联，保存抗原于原位。其特点是组织形态结构保存好，穿透性强，组织收缩少。但是，醛基与抗原蛋白氨基交联形成羧甲基，使抗原决定簇的空间构象出现障碍，可能部分或完全遮盖抗原决定簇，在免疫组织化学染色时产生假阴性结果。固定时缩短固定时间（824小时），降低固定温度（4℃）、固定后充分水洗、在免疫组织化学染色之前通过抗原修复等可提高抗原反应性。常用的有：10%福尔马林（即4%甲醛）、4%多聚甲醛（应用最为广泛）、2.5%戊二醛等戊二醛含两个醛基，对膜结构固定更好，但是形成更多的交联，对抗原活性有影响二、标本的制备2.固定(3)常用固定剂的种类及特点①单一固定剂：B.凝固沉淀固定剂丙酮、甲醇/乙醇、苦味酸、乙酸、三氯乙酸和氯化汞等：使组织细胞中的蛋白质、糖等物质凝固，优点是渗透力强，对抗原活性和酶活性保存较好；缺点是固定快，易使组织细胞收缩，小分子物质不容易保存，膜结构会破坏，因此对细胞结构保存不好。固定方法在4℃，30~60min为宜。C.其他固定剂铬酸、重铬酸钾、四氧化锇等四氧化锇：非电解质强氧化剂，与氨基酸、肽和蛋白质反应形成交联，保存微细结构作用好，对组织收缩和膨胀的影响小，电镜技术常用的固定剂二、标本的制备2.固定(3)常用固定剂的种类及特点②混合固定剂：Bouin固定液、Carnoy固定液、Zamboni固定液等Bouin固定液：甲醛、冰乙酸和饱和苦味酸按一定比例混合，是常用的混合固定剂，特点是穿透力强、收缩作用小、固定均匀，缺点是该固定液偏酸性，对抗原活性有影响Carnoy固定液：冰乙酸、氯仿和无水乙醇组成，适于固定染色体、DNA、RNA、糖原和尼氏体等，组织化学技术常用Zamboni固定液：多聚甲醛、饱和苦味酸和Karasson-Schwilt磷酸盐缓冲液组成，类似于Bouin固定液，对超微结构的保存优于Bouin固定液2.固定(4)固定的方法浸渍法、灌注法、滴片法、原位法、蒸汽法和微波法等，浸渍法和灌注法用的最多浸润法：适用于临床取材的标本和小动物组织固定，做好标记，直接将组织块修整为合适大小，投入到样品体积的40倍左右的固定剂中，固定剂的种类和固定时间的长短根据情况而定二、标本的制备2.固定(4)固定的方法：灌流法：适用于动物实验中对缺氧敏感的器官，如神经系统、胃肠等取材。二、标本的制备包括推注，滴注滴注步骤(大鼠)：开胸-暴露心脏-自心尖剪开左心室-插入灌流针至主动脉弓-固定灌流针-快速注入冲洗液，剪开右心耳-先快后慢注入固定液-慢注毕，将动物装入含少量固定液的塑料袋置4ºC冰箱内静置2h后取材（或立即取材），放入固定液中进行后固定大动物多采用输液方式，将固定液从一侧颈总动脉或股动脉输入，从另一侧切开静脉放血固定液的输入量因个体不同而异，500～2,000毫升不等冲洗液固定液动物2.固定(5)影响固定的因素：①组织块不宜过大：组织块过大会影响固定剂的渗透②固定液的量要合适：固定液的量要超过组织块大小的20倍-30倍，可在固定组织的瓶底垫上脱脂棉或几层滤纸，保证组织块各个方向都有利于固定剂的渗入③选择合适的固定剂：根据不同的组织以及后续研究方法的特点选择合适的固定剂，渗透性强，又不使组织过度收缩或者膨胀④固定时间的长短：根据固定剂的种类、组织块的大小和性质、气温等不同而确定，固定时间太短，不能保持组织块的微细结构，固定时间过长，会降低组织内物质的反应活性，如酶的活性，对抗原的保存也不利(5)固定后的洗涤：根据不同情况充分洗涤二、标本的制备3.包埋（embedding）(1)包埋的目的：将某种特殊的支持物质浸入到组织块内部，利用支持物（即包埋剂）的理化特性（如由固态变液态，液态变固态等），将整个组织加以包裹，最后凝固成均匀一致的固态结构，用切片机切成极薄的切片(2)包埋剂的种类：非水溶性：石蜡、树脂、火棉胶等，包埋前必须脱水和透明水溶性：明胶、OCT（聚乙二醇和聚乙烯醇的混合物）等，包埋前不需要脱水和透明二、标本的制备3.包埋(3)石蜡包埋：石蜡与水不相溶，包埋前必须脱水和透明，然后用熔化的液态石蜡对组织进行浸透，将浸透好的组织和石蜡放在室温条件下让其凝固，方便切成极薄的切片①脱水（dehydration）：用脱水剂置换组织中的水分，脱水会使组织收缩、变脆，因此脱水剂的浓度由低到高，采用合适的脱水剂和脱水时间（与组织块大小和结构性质相关），最常用的为乙醇，组织比较致密可用正丁醇二、标本的制备*柔软的组织可从更低的浓度开始，脱水的容器密闭性要好，防止吸收空气中的水分3.包埋(3)石蜡包埋：②透明（clearing）：脱水剂一般跟石蜡不互溶，用透明剂置换脱水剂，并使组织呈现透明状态，便于浸蜡和包埋常用透明剂为二甲苯、苯、甲苯、氯仿、正丁醇、香柏油等二甲苯透明能力强，易使组织收缩变脆，因此时间不能太长。可以经常观察透明进展。如果脱水不彻底，会出现“枣核”样的非透明区，必须返回到脱水剂中重新彻底脱水二、标本的制备3.包埋(3)石蜡包埋：③浸蜡（paraffininfiltration）：使熔化的石蜡液浸入到已经透明的组织中，彻底置换掉透明剂。浸蜡选择熔点为58~60ºC的石蜡，制备免疫组织化学标本应该选用更低熔点的石蜡，更换1~2次，每次0.5~1小时*浸蜡和包埋所用的石蜡必须经过熔化后用滤纸过滤除去杂质*将组织块从透明剂中移入到液态的石蜡中时，动作要迅速，否则液态的石蜡很容易凝固，影响到浸蜡的效果二、标本的制备3.包埋(3)石蜡包埋：④包埋（embedding）：将已浸蜡的组织块置入装有新熔化石蜡的包埋模具内，移出烤箱，即会迅速冷却凝固，包埋时注意将标本的切面向下，即标本的切面接触包埋模具的底面*将组织块从浸蜡中移入到包埋模具中，动作要非常迅速，否则石蜡很容易凝固，影响包埋效果*包埋的温度不能过高或者过低，普通组织学染色可以在65ºC，免疫组织化学染色不能高于60ºC二、标本的制备3.包埋(3)石蜡包埋：⑤修块：石蜡凝固后，组织便包封在石蜡内。切片前需把包有组织的蜡块修成一定形状，并且把各个面修平，注意不能使蜡边与组织边靠得太近亦不能太远，近则不易连片，远则废切片刀。在修块时选适当的地方做标记，便于日后辨认二、标本的制备3.包埋(4)火棉胶包埋：常用于较大组织和器官的包埋，如大小脑，以及容易塌陷的器官，如眼球和胚胎器官等，对组织的收缩作用小，保持原有结构的效果好，但火棉胶包埋所需时间长，包埋的组织块不能做薄切片和连续切片①火棉胶溶液配制：称取干燥的固态火棉胶，溶解于100ml的乙醚-无水乙醇（比例是1:1）配制成2%、4%、8%、16%的火棉胶液备用。火棉胶不易溶解，将其置入棕色瓶子内，经常摇动*固体状态的火棉胶和配制成液体的火棉胶，均是易燃品，因此使用过程中要避开明火*火棉胶容易吸收水分而成乳白状，在贮存和使用过程中要注意防水二、标本的制备3.包埋(4)火棉胶包埋：②包埋：梯度酒精脱水，乙醚-无水乙醇浸泡24h，（不需透明）在不同浓度的火棉胶中分别浸泡24h到1周，取出后放入含足量16%火棉胶的包埋盒中③硬化：继而放入干燥箱内放置24h，开启盒盖，使乙醇和乙醚挥发，包埋块逐渐硬化呈胶样，去掉包埋盒，包埋好的组织块放入70%乙醇或氯仿中24h，最后放入1:1的95%乙醇-甘油中保存备用二、标本的制备3.包埋(5)树脂包埋：以树脂作为包埋剂，包埋质地坚硬，易于制作很薄的切片。电镜水平的标本包埋常用环氧树脂，其包埋方法见《电子显微镜技术》中“超薄切片技术”，光镜水平的标本包埋常用水性树脂-甲基丙烯酸-2-羟基乙基酯①包埋剂配制：分别配制浸透剂和催化剂②标本固定和脱水：醛类固定剂常用，梯度酒精脱水，但是脱水可不彻底③包埋：先入浸透剂，后入浸透剂和催化剂混合液中进行聚合包埋二、标本的制备4.切片（section）必须切成薄片才能染色重点介绍石蜡切片、冰冻切片和振动切片(1)石蜡切片：优点：切片较薄，4~8µm，组织结构保存好，抗原定位准确，连续切片缺点：脱水透明及高温包埋，处理时间长，抗原活性容易受损，脂类物质等易被溶解过程：固定蜡块-调整切面-修块-调整切片厚度-切片-展片-贴片-烤片二、标本的制备4.切片（section）(2)冰冻切片（恒冷箱切片机）：优点：不用脱水透明高温包埋，处理时间大为缩短，抗原保存较好，可用于未固定的标本切片缺点：容易形成冰晶，切片较厚，10~40µm，结构清晰度不如石蜡切片防止冰晶形成的方法：①高渗蔗糖溶液处理：20%-30%蔗糖•PB溶液浸泡1~3天，组织块沉底②速冻：放组织块入-80ºC干冰或-196ºC液氮中速冻，或者将组织块固定在将温度已经下降到-50ºC的冻头上速冻*速冻前组织块都经过高渗蔗糖浸泡过过程：开机预冷-组织包埋（用OCT包埋组织于切片托上）-切片-贴片-干燥-保存（如长期保存可存放于-20ºC，如短期可室温放置，但防尘）二、标本的制备4.切片（section）二、标本的制备(2)冰冻切片（恒冷箱切片机）：(3)振动切片：利用振动切片机的振动，使刀片横向往复切割，将组织切成薄片优点：因组织不冷冻，无冰晶形成，染色前又避免了组织脱水、透明、包埋等步骤对抗原的损害，故能较好地保留组织内脂溶性物质和细胞膜抗原，标本可以是经过固定的或者新鲜的（少数情况下）缺点：切片较前两种方法厚，20~400µm，结构清晰度较差二、标本的制备4.切片（section）4.切片(4)防脱片处理：A.载玻片和盖玻片的处理B.黏附剂的使用------蛋白甘油------铬矾明胶液：铬矾（0.05%）、明胶（0.5%）和叠氮钠（0.01