GST纯化步骤(精)

GST融合蛋白纯化方法1目的片段接入pGEX载体；2涂板，挑单克隆，摇菌至OD600≈1.0，加入IPTG（终浓度1mM）诱导6－8h；3收菌，每升菌液约以50mLPBS重悬，加入1%TritonX-100（v/v），1％β-巯基乙醇（v/v），PMSF（终浓度1mM）；以下步骤均在冰上操作：4超声破碎菌体，15000g，10min离心取上清，在上清中加入适量GST-beads，轻轻晃动令其吸附蛋白1h；52000g，3min离心弃上清；6加入至少10倍体积PBS，轻摇至beads悬浮于溶液中，2000g，3min离心弃上清；7重复步骤6两次；8加入1mLGSTElutionBuffer，轻摇10min；92000g，3min离心，收集上清；10重复步骤8-9至少两次；11SDS-PAGE电泳检测蛋白纯度，Bradford法检测蛋白浓度；12将蛋白置于-20℃保存。P.S.大量提取前应取少量菌液，改变IPTG浓度，诱导温度，诱导时间等，以确定蛋白表达的最适条件。制备细胞裂解物：1.每100ml培养物的细胞沉淀悬于4mlPBS;2.加入溶菌酶至终浓度1mg/ml，冰上放置30min;3.用针筒将10ml0.2%TritonX-100强行注入细胞裂解物中，剧烈震动数次混匀；4.加入DNase和RNase至终浓度5ug/ml,4℃震动温育10min;5.4℃3000g(5000r/min)离心30min;6.上清转移到一只新试管，加入DTT至终浓度为1mmol/L;纯化融合蛋白：7.细胞裂解物与50%谷胱甘肽-琼脂糖树脂匀浆混合，每100ml细胞培养物加2ml树脂，于室温下轻摇30min;8混合物于4℃以500g(2100r/min)离心5min,小心去掉上清并留样少许进行SDS-PAGE;9.沉淀中加入10倍标准体积的PBS,颠倒离心管数次混匀，洗去未与树脂结合的蛋白；10.4℃以500g(2100r/min)离心5min,小心去掉上清并留样少许进行SDS-PAGE;11.重复步骤9和10两次；12.结合的GST融合蛋白可用谷胱甘肽洗脱缓冲液洗脱，也可用凝血酶，肠激酶或Xa因子切割，释放靶蛋白；用谷胱甘肽洗脱洗脱融合蛋白：a.沉淀中加入1倍柱床体积的谷胱甘肽洗脱缓冲液，室温轻轻搅动10min,洗脱树脂上结合的蛋白；b.4℃以500g(2100r/min)离心5min,上清移至新管中;c.重复步骤a和b两次，合并3次的上清；蛋白酶解从结合的GST融合蛋白上回收靶细胞：a.在结合了融合蛋白的树脂中加入凝血酶，肠激酶或Xa因子。每毫升树脂加入50单位荣誉1mlPBS的蛋白酶，颠倒离心管数次混匀，室温下震荡2～16h,用小规模实验确定精确时间；b.4℃以500g(2100r/min)离心5min,上清小心移至新管中;13.10%SDS-PAGE分析每一步（细胞抽提，洗涤和洗脱）样品的蛋白质组成。谷胱甘肽琼脂糖树脂的处理：1.轻轻颠倒盛有谷胱甘肽-琼脂糖树脂的容器，将树脂混成匀浆；2.取部分匀浆放入15ml聚丙烯管（每100ml细菌培养物需要2ml匀浆）；3.4℃以500g(2100r/min)离心5min,小心去掉上清;4.在树脂中加入10倍柱床体积的冷的PBS,颠倒数次，混合匀浆，4℃以500g(2100r/min)离心5min,小心去掉上清；5.每毫升树脂加入1ml冷的PBS，制成50%匀浆，颠倒数次，悬浮冰上放置待用。一、制取细胞的裂解物：1.每100ml培养物的细胞沉淀悬于4mlPBS缓冲液;2.加入溶菌酶至最终浓度1mg/ml，冰上或冷藏放置30min;3.用针筒将10ml0.2%TritonX-100强行注入细胞裂解物中，剧烈震动数次混匀；4.加入DNase和RNase至终浓度5ug/ml,4℃震动并温育10min;5.4℃3000g(5000r/min)离心30min;6.上清转移到一只新试管，加入DTT至终浓度为1mmol/L;二、纯化GST融合蛋白：1.细胞裂解物与50%谷胱甘肽-琼脂糖树脂匀浆混合，每100ml细胞培养物加2ml树脂，于室温下轻摇30min;2.混合物于4℃以500g(2100r/min)离心5min,小心去掉上清并留样少许进行SDS-PAGE;3.沉淀中加入10倍标准体积的PBS,颠倒离心管数次混匀，洗去未与树脂结合的蛋白；4.4℃以500g(2100r/min)离心5min,小心去掉上清并留样少许进行SDS-PAGE;5.重复步骤3和4两次；6.结合的GST融合蛋白可用谷胱甘肽洗脱缓冲液洗脱，也可用凝血酶，肠激酶或Xa因子切割，释放靶蛋白；三、用谷胱甘肽洗脱洗脱融合蛋白：1.沉淀中加入1倍柱床体积的谷胱甘肽洗脱缓冲液，室温轻轻搅动10min,洗脱树脂上结合的蛋白；2.4℃以500g(2100r/min)离心5min,上清移至新管中;3.重复步骤a和b两次，合并3次的上清；四、蛋白酶解从结合的GST融合蛋白上回收靶细胞：1.在结合了融合蛋白的树脂中加入凝血酶，肠激酶或Xa因子。每毫升树脂加入50单位1mlPBS的蛋白酶，颠倒离心管数次混匀，室温下震荡2～16h,用小规模实验确定精确时间；2.4℃以500g(2100r/min)离心5min,上清小心移至新管中;3.10%SDS-PAGE分析每一步（细胞抽提，洗涤和洗脱）样品的蛋白质组成。五、谷胱甘肽琼脂糖树脂的处理：1.轻轻颠倒盛有谷胱甘肽-琼脂糖树脂的容器，将树脂混成匀浆；2.取部分匀浆放入15ml聚丙烯管（每100ml细菌培养物需要2ml匀浆）；3.4℃以500g(2100r/min)离心5min,小心去掉上清;4.在树脂中加入10倍柱床体积的冷的PBS,颠倒数次，混合匀浆，4℃以500g(2100r/min)离心5min,小心去掉上清；5.每毫升树脂加入1ml冷的PBS，制成50%匀浆，颠倒数次，悬浮冰上放置待用。