白血病融合基因

白血病融合基因及其临床应用许泼实河南省人民医院检验科1白血病概述一类造血(或淋巴)干细胞的恶性克隆性疾病由于干细胞受损，其克隆中的白血病细胞失去进一步分化成熟的能力，或者增殖与分化能力不平衡，而停滞在细胞发育的不同阶段，在骨髓和其他造血组织中大量增生聚积，并浸润其他器官和组织，而正常造血受抑制。白血病细胞具有自我更新增强、增殖失控、分化障碍、凋亡受阻的特点，患者具有贫血、出血、感染和浸润等表现。2白血病分类白血病急性白血病(AL)慢性白血病(CL)急性淋巴细胞白血病(ALL)：L1L2L3急性非淋巴细胞白血病(ANLL)：M0M1…M7慢性淋巴细胞白血病(CLL)慢性粒细胞白血病(CML)3白血病流行病学我国白血病的年发病率为3/10万，急性比慢性多见，约5.5:1占男性恶性肿瘤第6位女性恶性肿瘤第8位在儿童和青少年中占第一位儿童ALL多见，成人ANLL多见。4白血病病因病毒物理因素化学因素遗传因素其他血液病5成人T细胞白血病…HTLV-I毛细胞白血病…..….HTLV-II各种射线，X、γ射线等苯及含苯有机溶剂染发白血病氯霉素、保泰松、乙双吗啉等药物家族性白血病（占7/1000）MDS、MPD、lymphoma、MM、阵发性睡眠性血红蛋白尿等最终可能发展为白血病。白血病相关融合基因大部分白血病中存在着染色体异常，涉及50种以上的染色体畸变，累及数目更多的融合基因；2000年WHO关于白血病分型的标准中更是将其中一些常见异常归纳入白血病基本诊断标准。对白血病融合基因进行常规检测，不仅可以为白血病诊断、分型、临床治疗选择和预后判断提供重要依据，同时也是白血病微小残留病变(MRD)监测的基础。BennelJM.WorldHealthOrganizationclassificationoftheacuteleukemiasandmyelodysplasticsyndrome[J].IntJHematol,2000,72:131-1336BCR/ABL融合基因：Ph染色体为第一个被发现的肿瘤专属染色体标记可见于90%～95%的CML20%～30%的ALL70年代，Banding(班带染色)进一步确定Ph染色体来自第9号与第22号染色体长臂的易位。80年代后,分子生物学证实了易位过程中的断裂点是位于9q34、22q11即t(9；22)(q34；q11)，转录产生8.5kb的融合mRNA。费城（Ph）染色体：PhiladelphiaChromosome7BCR/ABL融合基因：Ph染色体根据BCR基因断裂位点的不同分为三种类型b3a2P210bcr-abl见于CMLe1a2P190bcr-abl与部分ALL相关b2a2P230bcr-abl见于CNLBCR/ABL融合蛋白具有很强的酪氨酸激酶活性，可以调控细胞生长，参与细胞持续增殖信号传导或抑制凋亡，从而使骨髓造血干细胞过度增殖。8Ph染色体及Bcr/Abl检测的意义诊断：90％以上CML具有Ph+表达，可鉴别诊断类白血病反应和IMF监测：CML缓解期变急性期后，Ph+会消失，提示病情恶化；依据Ph染色体和bcr/abl融合基因，可将CML分为3类：(1)Ph+bcr/abl+：外周血象白细胞升高，骨髓粒细胞极度增生为主；(2)Ph-bcr/abl+：一组异质性疾病，实际上属于Ph阳性的CML范畴；(3)Ph-bcr/abl-：非典型CML；前两者具有相同的临床表现和血液学特征，为典型的CML，后者为非典型CML，正确区分对临床治疗、判断预后有一定的指导作用。9PML/RARα融合基因急性早幼粒细胞白血病(APL)的特异性分子标志，见于98%的APL病人。10PML/RARa融合基因正常RARα等位基因编码野生型维A酸受体，与维A酸结合可以调节多个靶基因的转录。PML是POD(PMLoncogenicdomain)多蛋白复合体(又称NB核体，ND10，是基因转录调控的重要组件)核心组分，PML通过转录共激活作用，可抑制肿瘤生长，在多种凋亡途径中起重要作用。两者相互易位造成以下后果：①维A酸核受体基因表达受抑制，使维A酸对靶基因转录调节功能丧失；②PML-RARα融合蛋白通过显性负抑制作用抑制早幼粒细胞分化成熟；③PML去定位使POD的结构破坏形成上百个细小颗粒分布在核及胞质中，其正常的抑制增殖和促凋亡功能发生障碍，导致细胞增殖，凋亡减少。祝毓林,等.北京大学学报(医学版),2005,37(3):236-238.黄纯兰。国外医学输血及血液学分册,2004,27(2):122-12511AML1/ETO融合基因M2b：急性粒细胞白血病部分分化型，阳性率90%。12AML1/ETO融合基因主要发生于M2的白血病中(40%)，M2b阳性率达90%，可作为M2b诊断的重要分子标志，少见于M4和M1，极少见于MDS；临床应用：AML的分子分型诊断和预后观察，其阳性时预后良好；AML1/ETO+白血病细胞有一定程度的分化能力，能分化至较成熟的嗜中性粒细胞和嗜酸性粒细胞，且对化疗反应较敏感，AML1/ETO+患者对大剂量阿糖胞苷治疗有效，完全缓解率高达98%，5年存活率达67%，预后较其他AML亚型（M3除外）好。所以对初发患者进行t(8；21)融合基因的检测对其预后判断及治疗方案的制定相当重要。13β/MYH11融合基因急性髓细胞白血病(AML)中急性粒-单核细胞白血病(M4)伴异常嗜酸粒细胞增多这一独特亚型被定名为AML-M4EO，绝大部分M4EO都提示有16号染色体结构异常，较为特异和常见的是16号染色体倒位。14TEL/AML1融合基因t(12;21)(p13;q22)，儿童前B-ALL最常见的染色体异常15E2A/PBX1融合基因T(1;19)易位在儿童前驱B细胞ALL(precursor-BALL)患者中占20～25%16E2A/PBX1融合基因见于5%左右的儿童ALL，在儿童前驱B细胞ALL(precursor-BALL)患者中占20～25%，其阳性与预后关系不明显，但是可作为ALL及MRD诊断的分子标志；对于携带有t(1;19)易位的ALL儿童采用更为强烈的化疗方案，可以改善其预后，5年无病生存率(EFS)已接近80％。PuiCH．NEnglJMed．2004:350:l535-l54817E2A/PBX1融合基因见于5%左右的儿童ALL，在儿童前驱B细胞ALL(precursor-BALL)患者中占20～25%，其阳性与预后关系不明显，但是可作为ALL及MRD诊断的分子标志；对于携带有t(1;19)易位的ALL儿童采用更为强烈的化疗方案，可以改善其预后，5年无病生存率(EFS)已接近80％。PuiCH．NEnglJMed．2004:350:l535-l54818MLL重排的融合基因：11q23混合谱系白血病(MixedLineageLeukemia，MLL)基因重排，是发生在11号染色体2区3带的基因重排，MLL蛋白包括3个功能区，分别是转录抑制区、转录激活区和DNA结合区(该区域有特征性的AT钩区和锌指结构区)，MLL基因重排使得AT钩区及锌指结构之间的序列发生断裂，在DNA修复时与其他基因之间发生融合。19MLL重排的融合基因：11q23MLL基因重排涉及五十余种染色体易位，产生不同的融合蛋白，且每种融合蛋白都与特定的白血病表型相关。最常见的有：t(4;11)(q21;q23)MLL-AF4融合基因ALLt(9;11)(p22;q23)MLL-AF9融合基因AMLt(11;19)(p13;q23)MLL-ENL融合基因AML及ALLMLL重排可以在大约85%的患B-ALL的婴儿中发现，与AML-M4/M5高度相关，是预后不良的指标，涉及MLL基因重排的白血病大多恶性程度高，对常规化疗不敏感，缓解率低，生存期短，已成为急性白血病中的一个特殊亚型。20MLL重排的融合基因：11q23至今，MLL相关融合蛋白的致病性还不清楚；推测其可能具有双重作用：——融合蛋白可能获得新的功能，促使细胞转化。——MLL发生断裂后，缺失锌指结构域的MLL不能与DNA结合，失去其转录活化功能，使受MLL调节的靶基因（HOX基因）表达异常，也影响造血细胞的发育。21SIL/TAL1融合基因：1p32缺失仅见于T-ALL，26%，是T-ALL特异性克隆标志。22常见白血病融合基因一览其它融合基因：随着白血病分子生物学研究的深入，已经有不少新的异常核型或新的融合基因发现，如DEK-CAN、AML1-MIG8、PLZE-RARa融合基因等，它们也将成为白血病分子诊断、预后判断及MRD诊断的分子标志。23融合基因的检测方法荧光原位杂交(FISH)巢式RT-PCR实时定量RT-PCR多重RT-PCR+寡核苷酸芯片24荧光原位杂交(FISH)基本原理：标记荧光素的单链DNA(特异性探针)和与其互补的DNA(标本)杂交,通过荧光信号的数量、位置反映标本相应特异性基因的情况。FISH定量准确，形象直观、特异性较强，灵敏度最高达10-2，不能满足临床对白血病和MRD检测水平的要求，应用受到限制。25荧光原位杂交(FISH)正常对照：2个红色信号2个绿色信号T(9;22)易位：2个红色信号1个绿色信号1个黄色信号T(8;21)易位：2个黄色信号1个红色信号1个绿色信号26巢式RT-PCR基本原理：巢式RT-PCR是一种变异PCR，使用两对PCR引物扩增同一个片段。第一对PCR引物扩增和普通PCR相似，第二对引物称为巢式引物，因为他们结合在第一次PCR产物内部，使得第二次PCR扩增片断短于第一次扩增片段。巢式PCR的优点是非常特异，如果第一次扩增产生了错误片断，则第二次能在错误片段上进行引物配对并扩增的概率极低。27巢式RT-PCR：需要跑电泳28实时定量RT-PCR基本原理：在普通PCR反应中加入能与PCR产物结合的荧光探针或荧光染料，并使它们发出的荧光信号随着扩增产物的增加而成比例增长，通过荧光探测仪实时检测每一个循环结束后的荧光强度，通过与标准曲线对比得出定量结果，可以直接检测目的基因的起始数量，从而动态监测融合基因水平。29多重巢式RT-PCR+寡核苷酸芯片基本原理：在巢式RT-PCR的基础上，在2轮PCR中均平行设置针对多组融合基因的引物，同时检测出多种融合基因的剪接形式，所有基因的第二轮上游引物在合成时用荧光素(Cy3)在5′端进行荧光标记，所有分型探针在3′端进行氨基修饰。这样经多重巢式PCR，一次扩增出多种可能存在的融合基因，再与所有分型探针在芯片上杂交，鉴定出具体的融合基因类型。30检测白血病融合基因的临床意义用于白血病分子诊断和疗效观察：很多融合基因如PML/RAP仅出现在急性早幼粒细胞白血病(APL)中，阳性率能达到98%，因而是一个非常好的APL分子诊断标志。同时文献报道APL初诊组、CR组和复发组的融合蛋白水平差异较大，初诊组的对数值较高，CR组较低，复发组又增高。说明检测PML/RAP融合基因既可辅助诊断APL，又可作为APL疗效观察、判断预后及监测复发的良好指标。31检测白血病融合基因的临床意义从分子水平确定完全缓解的新标准：目前以细胞形态学作为白血病临床缓解的标准已不能满足临床需求，随着实时定量RT-PCR在临床上的应用，可使临床医师进一步了解白血病患者缓解后体内的白血病细胞的动力学特性，获得一个从分子水平确定的完全缓解的新标准，从而能够对临床治疗反应作出正确评价，及时调整治疗方案，减轻患者经济负担，同时减少不必要的化疗造成的痛苦。32检测白血病融合基因的临床意义监测诊断白血病微小残留病变MRD：MRD是导致白血病复发的主要原因，常规细胞遗传学试验检测MRD的敏感性很有限(＜10-2)，FISH的敏感性也不高(＜10-3)，而且如果MRD水平很低时又很难与背景区别，目前就临床而言，对于染色体重