凝胶法检查技术

凝胶法检查技术湛江安度斯生物有限公司2016年6月11•凝胶法BET定义2•凝胶法BET试验程序3•试验器具4•鲎试剂灵敏度复核试验5•干扰试验6•检查法凝胶法检查技术2（一）凝胶法BET定义•定义：通过鲎试剂与内毒素产生凝集反应的原理进行限度检测或半定量检测内毒素的方法。•实验方法：337±1℃60±2min+（一）凝胶法BET定义•  结果判断•阳性：凝胶不变形、不从管壁滑脱者阴性：未形成凝胶或形成的凝胶不坚实、变形并从管壁滑脱者4（﹣）（+）5（二）凝胶法BET试验程序灵敏度复核试验干扰试验日常检查验证日常检查（二）凝胶法BET的试验程序试验准备确定样品内毒素限值选择试剂计算MVD鲎试剂灵敏度复核试验供试品干扰初筛试验干扰试验日常检查结果判断6（三）试验器具•1.设备•恒温仪器：---如干式恒温仪、恒温水浴箱•旋涡混合器---混匀细菌内毒素•温度计•计时器或时钟•微量移液器7需要定期校准！•1.设备•恒温干燥箱---具有250℃以上恒温的功能---验证：细菌内毒素灭活验证试验昀差装载运行3次---监控（建议）：用具细菌内毒素含量和干扰情况；8(三）试验器具•2.试剂•内毒素标准品（RSE或CSE）•细菌内毒素检查用水•凝胶法鲎试剂•其他辅剂（抗增液、稀释剂Ⅰ、稀释剂Ⅱ和分散剂等）9(三）试验器具用具分类试验用具名称反应试管无热原玻璃试管（外径10mm×75mm）稀释容器稀释试管、无热原安瓿(2ml/支，5ml/支）移液器具刻度吸管及洗耳球或移液器及无热原吸头等其他试管架、安瓿架、70%异丙醇浸泡的无纺布、镊子、剪刀、砂轮、封口膜或医用胶布、标记笔等3.试验用具10•凡是与供试品或反应试剂接触的器具，必须经除热原处理。(四）鲎试剂灵敏度复核试验•鲎试剂的标示灵敏度定义：在细菌内毒素检查法规定的条件下，使鲎试剂产生凝集的内毒素的昀低浓度；缩写：λ；单位：EU/ml；常用的凝胶法鲎试剂灵敏度有：0.5EU/ml、0.25EU/ml、0.125EU/ml、0.06EU/ml、0.03EU/ml；安度斯能稳定提供λ为0.015EU/ml的鲎试剂；比较：以上灵敏度昀高的是（）；昀低的是（）。11（四）鲎试剂灵敏度复核试验•实验目的验证实验室的条件是否满足BET实验的要求验证实验人员的操作技能是否满足BET实验的要求验证实验所用试剂（包括鲎试剂、内毒素标准品、BET用水等）是否满足BET实验的要求验证实验所用器具是否满足BET实验的要求12（四）鲎试剂灵敏度复核试验•试验步骤13开启恒温仪预热溶液C的制备鲎试剂的制备加样恒温反应结果判断数据处理操作步骤示意图稀释为2λ、λ、0.5λ、0.25λ内毒素标准溶液(C溶液)混匀*BET水复溶内毒素标准品：RSE或CSE按说明书要求鲎试剂单次试验试剂：原安瓿大装量试剂：反应试管鲎试剂复溶液复溶混匀轻轻转动瓶壁摇匀每步稀释于旋涡混合器混合至少30秒140.1ml鲎试剂＋0.1mlCSE(RSE)，平行4管NC：0.1ml鲎试剂＋0.1mlBET水，平行2管混匀（水浴恒温需封口）37℃±1℃，孵育60min±2min操作步骤示意图15结果判断：反应管缓缓倒转180º阳性（+）：凝胶不变形，不从管壁滑脱者阴性（-）：未形成凝胶或凝胶不坚实、变形并从管壁滑脱者实验有效：NC管全部阴性（－－）2.0λ管全部阳性（＋＋＋＋）0.25λ管全部阴性（－－－－）数据处理：灵敏度测定值λc=antilg（ΣX/n）X：为反应终点浓度的对数值（lg）鲎试剂灵敏度标示值λ有效：2λ≥λc≥0.5λ反应终点浓度是系列浓度递减的内毒素浓度中昀后一个呈阳性结果的浓度灵敏度复核试验举例•试剂试剂名称厂家规格标示效价数量鲎试剂安度斯0.1ml/支(1.25ml/支)0.25EU/ml18支(2支)内毒素标准品(CSE)安度斯10EU/支1BET水(W)安度斯50ml/瓶0.003EU/ml1161.试验前，将恒温仪预热至37℃2.0ml30s2.0ml2.0ml单位(EU/mL)30s130s0.4ml3.6ml10CSEBET水1.0ml混合5分钟30s2.0ml2.0ml2.0ml0.5(2λ)0.25(λ)2.0ml30s2.0ml0.125(0.5λ)0.06(0.25λ)2.标准内毒素溶液C的制备173.鲎试剂的准备(单次试验试剂)•取0.1ml装量，灵敏度为0.25EU/ml的鲎试剂18支，在安瓿颈部折断，按照阴性对照溶液D两管，标准内毒素溶液每浓度平行4管排列；•用精确移液器准确吸取0.1mlBET水分别加入每支鲎试剂中，使鲎试剂全部溶解分别加入0.1mLBET水复溶183.鲎试剂的准备(大装量试剂)•取1.25ml装量，灵敏度为0.25EU/ml的鲎试剂2支，在安瓿颈部折断，用精确移液器准确吸取1.25mlBET水分别加入两支鲎试剂中，使鲎试剂全部溶解。取18支（10×75）mm反应试管，按照阴性对照溶液D两管，标准内毒素溶液每浓度平行4管排列：•把两支鲎试剂合并后，分别取0.1ml鲎试剂溶液分装到18支反应试管中。分别加入0.1mL复溶后的鲎试剂溶液194.加样•用精确移液器分别吸取0.1ml的0.5EU/ml、0.25EU/ml、0.125EU/ml、0.06EU/ml的标准内毒素溶液C，加入复溶后的0.1ml/支规格的鲎试剂原安瓿（或分装有0.1ml鲎试剂的反应试管）中，每浓度平行4管，吸取0.1mlBET水（溶液D）加入另外两管，作为阴性对照0.06EU/ml分别加入CSE0.1mLBET水0.5EU/ml0.25EU/ml0.125EU/ml鲎试剂原安瓿反应试管加样顺序从低浓度到高浓度205.恒温反应•将加样完的鲎试剂混合液轻轻摇匀（避免产生气泡），垂直放入37±1℃的恒温器中孵育60±2分钟（孵育过程中避免振动影响凝胶形成）•若恒温装置是水浴恒温箱，那么在加样后需将反应管封口，避免水蒸气进入反应管内造成污染21结果判断：反应管缓缓倒转180º阳性(+)：凝胶不变形，不从管壁滑脱阴性(-)：凝胶不能保持完整，从管壁滑脱＋＋＋＋ －  － －   －阳性阴性6.结果判断226.结果判断23试验符合要求的基本条件：NC管全部阴性（－－）2λ管全部阳性（＋＋＋＋）0.25λ管全部阴性（－－－－）当λc在0.5λ～2λ（包括0.5λ和2λ）时，方可用于细菌内毒素检查，并以标示灵敏度λ为该批鲎试剂的灵敏度。7.数据处理举例0.125平行管内毒素标准溶液浓度(EU/ml)NC反应终点浓度X（lg反应终点浓度）0.50.250.061＋＋－－0.125－0.9032＋＋－－－0.25－0.6023＋＋－－－0.6024＋＋－－0.25－0.602＋0.2524λc=antilg（ΣX/n）=antilg{[(－0.903)＋(－0.602)＋(－0.602)＋(－0.602)]/4}=0.210EU/ml即本批号鲎试剂的复核灵敏度（λc）为0.210EU/ml结论：本批鲎试剂的灵敏度标示值符合规定。7.数据处理举例25何时需做这个试验呢？1、使用新批号的鲎试剂或内毒素标准品2、试验条件有任何可能会影响检验结果的改变26(五）干扰试验•目的：确定供试品在某种浓度下是否适合做细菌内毒素检查。•原理：通过比较鲎试剂与内毒素在水溶液和供试品溶液中反应的差异程度，来确定供试品在该浓度下是否对BET检查有干扰。•至少对3批样品进行干扰试验27(五）干扰试验-反应项目设置28编号内毒素浓度/配制内毒素的溶液稀释用液稀释倍数所含内毒素的浓度平行管数A无/供试品溶液——————2B2λ/供试品溶液供试品溶液12λ421λ440.5λ480.25λ4C2λ/检查用水检查用水12λ221λ240.5λ280.25λ2ChP“4”（2010年）(五）干扰试验-反应项目设置•注：A为供试品溶液；•B为干扰试验系列；•C为鲎试剂标示灵敏度的对照系列；•D为阴性对照。•供试品溶液要求：未检验出内毒素的溶液即不与所用鲎试剂产生坚实凝胶；不超过昀大有效稀释倍数（MVD）的溶液。如有可能，请留一个安全系数。29(五）干扰试验结果判断：当溶液A和溶液D的所有平行管都为阴性，并且系列溶液C的结果符合鲎试剂灵敏度复核试验要求时，试验方为有效。当系列溶液B的结果符合鲎试剂灵敏度复核试验要求时，认为供试品在该浓度下无干扰作用。30灵敏度复核试验的要求是什么？新品种建立方法-两个厂家鲎试剂鲎试剂的来源改变鲎试剂的配方、生产工艺改变供试品的来源改变供试品的配方、生产工艺改变试验环境中发生了其它有可能影响试验结果的变化在何种情况下需做干扰试验？31试验步骤试验材料的准备供试品限值的确定鲎试剂的选择MVD的计算反应溶液的制备加样及反应结果判断32(五）干扰试验•干扰试验通常分为两个阶段：干扰初筛试验-初步筛选出供试品无干扰浓度范围和鲎试剂灵敏度范围；-非药典要求！干扰试验33(五）干扰试验•经常接到用户的咨询电话，样品日常检查需要选择什么灵敏度的鲎试剂来检测？例如：•我们产品的细菌内毒素限值是0.06EU，需要订什么灵敏度的鲎试剂，0.03可以吗？•A、细菌内毒素限值单位不明确，是EU/ml还是EU/mg还是……？单位不同，选择鲎试剂灵敏度范围不同；•B、0.03EU/ml的鲎试剂可不可以，要做干扰试验来确定；•C、通常可先做干扰初筛试验，初步筛选出鲎试剂灵敏度和无干扰浓度范围，再做干扰试验确认。341.干扰初筛试验•目的及原理–本试验是药品与鲎试剂相容性的筛选试验，通过对一系列含2λ内毒素浓度的样品溶液与鲎试剂的反应，初步筛选出样品对鲎试验无干扰的浓度–本试验不是药典规定的试验35试验步骤•试验材料的准备•供试品限值的确定从国家药品标准、企业标准中查出L按公式计算：L=K/M•试剂的选择可使用任一灵敏度的鲎试剂；一般为了试验的方便，选择灵敏度低的鲎试剂；36试验步骤•供试品昀大有效稀释倍数的确定•例：某样品的内毒素限值为0.5EU/ml，则可以稀释的倍数和浓度范围如下37灵敏度λ（EU/ml)0.50.250.1250.060.03MVD0.5MVD0.25MVD0.125MVD0.06MVD0.03稀释倍数124816试验步骤•反应溶液的制备溶液A：将供试品稀释至鲎试剂常规灵敏度下所对应的MVD溶液B：含2λ浓度标准内毒素的溶液A溶液C：2λ浓度的标准内毒素溶液溶液D：BET水38试验步骤•加样及反应0.1ml鲎试剂溶液+0.1ml各反应溶液，各平行2管•结果判断试验有效条件：溶液D：（--）；溶液C：（++）；无抑制干扰：溶液A：（--）；溶液B：（++）39举例：苦参素原料药干扰初筛试验•（1）供试品限值–企业内控标准：＜0.2EU/mg40（2）试剂•为了方便试验，干扰初筛试验中一般选择灵敏度较低的鲎试剂作试验。试剂名称厂家规格标示效价数量鲎试剂安度斯0.1ml/支0.25EU/ml24内毒素标准品（CSE）安度斯10EU/支1BET水（W）安度斯50ml/瓶0.003EU/ml141（3）昀大有效稀释倍数的确定–昀小有效浓度计算：C=λ/L–使用λ=0.5EU/ml灵敏度的鲎试剂时，–C0.5=–因此可计算出使用不同λ时所对应的C：灵敏度λ（EU/ml）0.50.250.1250.060.03对应的浓度（mg/ml）2.51.250.6250.30.150.5EU/ml0.20EU/mg=2.5mg/ml42（4）各反应溶液的制备注:S2.5表示供试品2.5mg/ml，下标表示供试品浓度;E0.5表示内毒素的浓度为0.5EU/ml。溶液编号AD溶液内容S