血片制作染色和血检质量控制3（PPT41页)

1一、血片制作血膜的制作用于检查疟原虫的血涂片有两种：一种是将血液涂呈薄膜状，称薄血膜；一种是血液涂成圆盘，称厚血膜。薄血膜上的血细胞要求平辅在玻片上面。发热病人血片标本片2血膜的制作（取血时间）取血时机现症病人一般可随时取血，疟疾普查时可不考虑取血时机。但在诊断或需要某期疟原虫作标本时，则应掌握适宜的取血时机。间日疟在寒热发作时，外周血液中主要可见环状体期；发作后数小时，环状体发育到滋养体期，疟色素形成，形态较易辩认，为诊断的有利时机；36~48小时，可检出裂殖体；发作一、二次后，配子体出现较多。恶性疟较理想的取血时间是在发作后至20小时内取血，初发患者退热后常查不到原虫。3血膜的制作（取血操作）取血方法采血部位一般人为耳垂，指头，通常在耳垂取血（现场取血用采血针采血，一人一针，避免血传疾病）先用75%酒精棉球消毒取血部位（冬季用手捻动耳垂使其充血后再行消毒），待酒精干后，用左手拇指和食指紧捏耳垂上方，右手持消毒针迅速刺入耳垂下端1~2毫米，不宜过深或过浅。然后用右手中指轻轻向上挤压出血。4取血量及涂片法（涂片操作）薄血膜取洁净的载玻片2张，1张平置在桌上，以左手拇指，食指夹持载玻片两端（手指切勿接触玻片表面），用另一张边缘平滑（最好为磨口边缘）的载玻片做推片，用推片一端边缘的中点从取血部分取约1微升的血量（相当于1/4火柴头大小），使血滴与平置的载玻片接触，并形成25~30度夹角，待血液向两侧扩展约2厘米长度时，均匀而迅速地轻轻向左推出（约2.5厘米长）。5（涂片操作）厚血膜用推片的一角，从取血部位刮取约4微升血量（相当于火柴头大小），使血滴与平置的载玻片接触，再由里向外或由外向里一个方向旋转，转2~4圈，涂成直径0.8~1厘米大小圆形厚血膜，血膜厚薄均匀，过厚易于脱落，过薄达不到检出率的要求。6血膜的制作（涂片操作）涂制厚、薄血膜的位置通常是将厚、薄血膜涂在一张载片上。方法是将载片分为6等分，第1、2格备贴标签及编号用；厚血膜涂在第3格中央，薄血膜涂在第4格前缘至第6格中部。作为标本的血片每张玻片涂厚、薄血膜各1个；门诊和发热病人血片涂2个厚血膜1个薄血膜，以防血膜脱落而影响检查；疟疾调查时，每张玻片可涂制2~3人血膜。7血膜的制作血膜编号血膜制成后，立即用特种蜡笔或水笔于玻片面上写上受检者的号码，以防差错，待薄血膜干后再用铅笔于薄血膜中写上血片种类的代号和受检者的个人编号，依次顺序插入标本盒内。8制作血膜的注意事项1.玻片清洗时，避免玻片碰撞、磨损。制作血膜的载玻片必须完全清洁而毫无油渍或污垢。制片时，手指只能持载片的边缘，不能接触玻片表面，以免油污使薄血膜产生空白区以及厚血膜脱落。作为推片的玻片边缘一定要平滑，才能使推出的血膜均匀一致。9制作血膜的注意事项2.刚涂制的血膜要平放在标本盒内，厚血膜未干前勿使标本盒倾斜，以免血膜倾向一侧，造成血膜厚薄不均，厚处不一溶血和着色而影响检查结果；晾干血膜时应注意防尘、防止苍蝇、蟑螂等昆虫吮吸血膜，干后应及时装入标本盒并盖严，新的木制标本盒需敞开放置一段时间，让木醇挥发后才能使用，以免厚血膜红蛋白被其固定，不能溶血或染色效果不佳。10制作血膜的注意事项3.血膜让其自然干燥，切忌用太阳晒或火烤，干透后才能用甲醇固定薄血膜。夏天标本尽可能24~48小时内固定染色；冬天也不能超过72小时。放置时间越久，厚血膜越不易溶血，染色效果也差。若不能及时染色，膜血膜宜先用甲醇固定（1~3分钟）然后用过滤清水对厚血膜溶血，晾干固定后装入盒内盖严，待以后染色。11二、血片的染色（一）染液的种类及染色原理染液种类：目前所用的血片染色液，虽然名称很多，但都是从罗门诺夫斯基氏创造的染液变化过来的。总的可分为水溶液和酒精溶液两大类，前者包括罗氏、西氏（Simon)、J.S.B氏染液等，后者包括利氏(Leishman)、瑞氏和吉氏染液等。这些染液中的主要染剂都包含美兰、伊红和由美兰氧化所成的天青，所以称多色性染剂。12血片的染色（一）染液的种类及染色原理染色原理：伊红是酸性水溶性钠盐，美兰是碱性水溶性盐酸盐，当它们各自溶化水中时，就离解为带阳电和阴电的离子。伊红主要离解为酸性的阳离子，在遇到碱性的蛋白质如血红蛋白、嗜伊红白血球颗粒等即可结合成不易溶于水的沈淀物染成红色。美兰主要离解为碱性的美兰离子，美兰就与疟原虫、淋巴和大单核细胞的胞浆、嗜碱性白细胞的颗粒等酸性蛋白质结合染成兰色。#13血片的染色（一）染液的种类及染色原理染色原理：美兰与伊红都不能使原虫和白细胞的核着色，必须由天青作为媒介（染媒）才能使其着色。天青虽然也是碱性染剂，但又具有染媒作用，使原虫核和白细胞核等原来只能染上极淡兰色的结构染上显著的酸性染剂伊红，这样，就使白细胞粗大的核染成显著的既兰又红的紫兰色，而较小或菲薄的原虫核和淋巴细胞原浆中的颗粒染成紫红色。14血片的染色（一）染液的种类及染色原理注意：蛋白质是二性电解质，当其处于较等电点为酸的溶液中时，便呈硷的作用，即与酸结合*，这就说明为何在染液偏酸时，伊红的着色力强，使红细胞着色鲜艳而淋巴细胞和原虫的胞浆着色不著；反之，蛋白质在偏硷的溶液中呈酸的作用而中和硷基，也就说明为何染液偏硷时，红细胞和嗜伊红白细胞的颗粒等被染成紫兰色。伊红在水溶液内遇到美兰或天青，时间一长即可互相化合而产生沈淀从而失去染色力，因此，吉氏母液绝对不能进水。15血片的染色（二）吉氏染液母液配置方法取吉氏粉0.5克置于研钵中，加少量甘油充分研磨，再加再磨，至25毫升加完为止，倒入60或100毫升带有玻塞的有色玻瓶中。在研钵中加少量甲醇，洗去甘油浓液混入瓶内，至25毫升甲醇洗净钵中甘油染液为止，塞紧瓶塞，充分摇匀，置于55~60℃水浴中或温箱内24小时或室温内3~5天，多加摇动，即成原液。吉氏染液是目前较优良的血膜染剂，即使在炎热天气中，亦可经久不变。材料：1、吉氏粉0.5克2、甘油25毫升3、甲醇25毫升16血片的染色（三）吉氏染液血片染色方法先用甲醇或无水酒精固定薄血膜，待干后进行染色。亦可在固定薄血膜后用清水对厚血膜溶脱血红蛋白，然后才进行染色。成批血片染色：将已固定薄血膜的血片插入染色缸，倒入2%吉氏染液稀释液（2毫升原液加中性蒸馏水98毫升稀释均匀即成），同时对厚薄血膜染色30分钟（如染液不合标准时，得酌情增减染色时间），然后用清水轻轻将染液冲去，再用清水轻轻冲洗一次，干净后将血片标本（血膜面朝下）插于晾干板上，待干镜检。17血片的染色（三）吉氏染液血片染色方法先用甲醇或无水酒精固定薄血膜，待干后进行染色。亦可在固定薄血膜后用清水对厚血膜溶脱血红蛋白，然后才进行染色。单张血片染色：薄血膜经固定干燥后，用2%吉氏染液稀释液1~2毫升，滴入血片标本上染色30分钟左右，或用中性蒸馏水1毫升，加吉氏母液1~2滴，混合均匀后滴入血片标本上，染色10~20分钟，然后用清水轻轻将片上的染液冲洗干净，晾干镜检。18影响染色效果的因素血片染色好坏除了与玻片是否清洁，血片制作质量好坏等有关外，还受到以下几个因素的影响：（1）染料溶剂的质量染料、甲醇和甘油如果不纯，常使配制的染液偏酸或偏碱而影响染色效果。因此必须用分析纯的甲醇和中性甘油，而且在配制时所用的器具必须干净而无水份。19影响染色效果的因素（2）染液的新旧新配制的染液因色素尚未充分溶解，染色力较弱且常呈现偏碱性。染液存放时间越久，染色力越强。通常在染液配制1~2周后才使用，盛装染液的瓶子应加塞盖密。以防吸潮而影响染液质量。20影响染色效果的因素（3）染液稀释后使用时间吉氏和瑞氏染液的主要成份是美蓝、伊红和由美蓝氧化产生的天青，三者能在酒精溶液中溶解，但在水溶液中伊红遇到美蓝和天青即产生沉淀。因此，必须在稀释染液当时使用，一般在半小时内染色力最强。21影响染色效果的因素（4）染液的稀释浓度染液的浓度高其着色就快而深，从而疟原虫寄生红细胞的薛氏点粗大显著，但颜色常偏碱；染液浓度过低则染色时间久，颜色偏酸，薛氏点不明显或消失。22影响染色效果的因素（5）染色时间染色时间长染色效果好，反之较差。室温高则着色快，染色时间可略缩短，气温低可适当延长。因此染色时间应根据染液的质量、新旧、稀释浓度和气温而适当增减。23影响染色效果的因素（6）染色用水染液的稀释用水和染色后冲洗用水应选择Ph7.0~7.2清洁水，通常使用的新鲜的蒸馏水或过滤的冷开水，以及自来水、井水、河水、泉水和雨水等。如果偏酸或偏碱，可用缓冲蒸馏水调整。染色后发现血膜颜色偏蓝（偏碱）或偏红（偏酸）时，可用与之相反的酸、碱度水冲洗血片予以纠正。24影响染色效果的因素（7）染色后不要直接将染液倒掉，应沿玻片或染色缸边缘加水使染液表面一层溢出，并轻轻冲洗，以免染液色素颗粒沾污血膜。25三、发热病人血检的质量控制19世纪后期，显微镜的出现使人们不断发现了传染病的病因，1880年法国军医拉韦朗（Laveran）第一次见到并描述了人红细胞内的疟原虫，至此才解开了困扰人们数千年的疟疾的病因之谜。26三、发热病人血检的质量控制此后，随着显微镜的不断改进和血膜上疟原虫染色方法的出现，使显微镜检查疟原虫的方法成为疟疾病原学诊断的重要手段。尽管这种方法存在着操作复杂、技术难于掌握等缺点，但以其高特异性一直被作为确诊病例主要依据。时止今日，由于技术的、经济的等原因，镜检疟原虫仍是我国疟疾病例确诊的金标。27三、发热病人血检的质量控制在疟疾诊断标准中把疟疾病例分为疑似病例、临床病例、确诊病例和带虫者，前两者依据流行病学史和临床表现即可做出诊断，而后两者需通过发现病原方能做出诊断。另外，除带虫者外，病例的最基本临床表现为发热。1、目的与意义28三、发热病人血检的质量控制因此血检的目的在于通过对发热病人血检达到确诊疟疾病例。它的意义在于及时发现传染源和明确感染的疟原虫种类，以能针对虫种选择正确的治疗方案。1、目的与意义29三、发热病人血检的质量控制在疟疾严重流行时期，卫生部有关文件中提出，疟区的各级医疗卫生单位，都要把发热病人血检疟原虫列为常规。2、血检对象30三、发热病人血检的质量控制2、血检对象但根据20世纪80年代各地的观察结果表表明，全部血检阳性的病例中，有47.8%（江苏）、73.5%（山东）、77.7%（南方7省）、84.1%（河南）是在临床初诊为疟疾、疑似疟疾的发热病中查出的，而其它15%~42%的病例，是在临床初诊为发热原因不明和感冒及其它发热病人中查出的。31三、发热病人血检的质量控制2、血检对象因此，为尽可能多地发现病人，各地把临床初诊为疟疾、疑似疟疾、发热原因不明和感冒及其它发热的“四热”病人列为血检对象。32三、发热病人血检的质量控制2、血检对象但是，随着疟疾流行程度的降低，“四热”病人中查出的疟疾病例所占的比例也发生了变化。上世纪90年代初，在全国10省、区发病率稳定在1/万以下地区开展研究，发现92.33%的病例发生在临床诊断为疟疾、疑似疟疾（包括来自高疟区流动人口）中（见表）。33三、发热病人血检的质量控制2、血检对象临床初诊血检人数阳性人数阳性率%占总阳性人数%疟疾1093167064.4964.24疑似疟疾247332932.3528.09发热原因不明10602760.027.29其它9608440.0040.38表各类发热病人血检原虫阳性率34三、发热病人血检的质量控制2、血检对象表中显示，在诊断为发热原因不明的病人中，原虫阳性率仅为0.02%，也就是说检出1例病人要镜检5000张以上血片；而在“其它”发热病人中检查2.4万病人方检出1例病人。35三、发热病人血检的质量控制2、血检对象因此提出发病率在1/万地区，由于92%以上的病例在诊断为疟疾、疑似疟疾（包括来自高疟区流动人口）“二热”病人中发现，因此以“二热”病人为血检对象即可。至于在发热原因不明中查出的7%病例，可在其出现疑似疟疾的症状时再做血检，这就极大的减少了工作量。36三、发热病人血检的质量控制2、血检对象提供以上资料，仅供在确定血象时参考，各地可根据当地的疟疾流行程度、血检的具体目