第四章-核酸的分子识别

第四章核酸的分子识别核酸是重要的生命物质基础，对生物的生长、发育和繁殖等有重要作用。许多分子可以与核酸发生相互作用，破坏其模板作用，使核酸链断裂，进而影响基因调控和表达功能。小分子不仅可作为生物探针用于核酸的结构与功能研究，还可以核酸（DNA，RNA）为靶目标作为抗肿瘤、抗病毒、抗菌等药物的母体。因此，测定小分子化合物与核酸相互作用的亲和力，了解其相互作用的选择性有利于进一步探讨小分子的结构与核酸作用模式及其生物活性之间的关系。第一节DNA的分子识别小分子化合物与生物大分子DNA特异性的定位结合，在基因表达的调控过程及很多抗癌药物的体内作用方式的研究中非常重要。第一，DNA靶向化合物可以作为核酸探针的选择对象；第二，临床上使用的许多抗癌药物都以DNA为作用靶点，通过与癌细胞DNA发生相互作用破坏其结构，进而影响基因调控与表达功能，表现出抗癌活性；第三，一些致癌物也能与DNA形成加合物，这种DNA加合物也是可能癌变的预警标志物。因此，小分子与DNA的相互作用的研究不仅有利于探索和开发新的核酸探针，而且有助于从分子水平上了解抗癌药物的作用机理，阐明有毒物的致癌、致畸的分子生物学机理，为设计临床上更为有效的抗癌药物提供理论指导。一，DNA的结构类型1953年，Watson和Crick在前人工作的基础上，首先提出DNA分子的右旋双螺旋结构。他们是以在生理盐溶液中抽出的DNA纤维，在92%相对湿度下进行X—射线衍射图谱测定而推设的，在这一条件下得到的DNA，称为B-DNA。经过二、三十年的研究，人们发现DNA不仅能形成右手双螺旋，也能形成左手双螺旋，甚至还能形成三股螺旋和四链体等多种形式。(a)G-四链体(b)i-四链体(c)左旋发卡结构(d)平行三螺旋(e)A-配对模式(f)交叉节1，DNA的右手双螺旋结构DNA双螺旋是由两条走向相反的互补脱氧多核苷酸链组成的右手螺旋，螺旋的外侧是磷酸和脱氧核糖间隔排列连接成的亲水主链，内侧是疏水的A-T、G-C碱基对彼此由氢键相连，双螺旋表面形成一条大沟和一条小沟。DNA的构型除主要以Watson和Crick提出的右手双螺旋构型（B-DNA）存在外，还有许多变型。也就是说DNA的结构是动态的，DNA可以随着环境的变化通过将自身扭曲、旋转、拉伸的方式把自身的构型调整为另一种完全不同的结构。如在相对湿度为75%测出的DNA分子是A构象(A-DNA)，这一构象不仅出现于脱水DNA中，还出现在RNA分子的双螺旋区域和DNA-RNA杂交分子中，因此在DNA转录时，很可能发生B→A型的转变。将相对湿度进一步降到66%时，就会出现C型DNA(C-DNA)，这一构象仅在实验室中观察到，在生物体中还未发现。而活细胞中绝大多数DNA以B-DNA形式存在。这些研究表明DNA分子结构在不同条件下可以有所不同，但它们均为右手双螺旋，且螺旋的表面都有一条大沟和一条小沟。B-DNA036.00.3373.410C-DNA638.00.3313.19.3D-DNA45.00.303双螺旋碱基倾角/(°)碱基夹角(°)碱基间距/nm螺距/nm每轮碱基数A-DAN2032.70.2562.811DNA分子在水、乙醇中的B、A型双螺旋结构DNA双螺旋的结构差异来源于核酸骨架构象固有的可伸缩性，如五元糖环的可折叠性以及糖苷键的旋转。其中糖环的构型、碱基相对糖环的顺式或反式构型是核酸构型的重要结构特征。而除了Watson-Crick碱基配对方式(G-C之间形成3个氢键，A-T之间形成2个氢键)外，还发现有另外27种在任何2个碱基之间形成至少2个氢键的截然不同的可能方式。其中包括9种形式的嘌呤-嘧啶的碱基配对、7种嘌呤-嘌呤的碱基对、4种异型嘌呤-嘌呤的碱基对、7种嘧啶-嘧啶的碱基对。另一种著名的配对形式叫做Hoogsteen碱基配对，在腺嘌呤和胸腺嘧啶之间形成氢键。2，DNA的左手双螺旋结构1979年美国麻省理工学院的AlexanderRich和他的研究小组在研究人工合成的CGCGCG单晶时，发现该单晶呈向左的螺旋，且它的两条主链呈Z字形环绕分子，Rich就将这种独特的结构称为Z-DNA。后来发现在细胞DNA分子中也存在有Z-DNA结构。左手DNA双螺旋结构（Z-DNA）的形成是DNA单链上出现嘌呤和嘧啶交替排列所造成的，如CGCGCG或CACACA。在细胞内尽管DNA上具有这样的区段，但在正常情况下DNA仍形成稳定的B-DNA结构。只有当胞嘧啶的第5位碳原子甲基化时，在甲基的周围形成局部疏水区，这一区域扩展到B-DNA大沟中，使B-DNA不稳定而转变成Z-DNA。这种C5甲基化现象在真核生物中是常见的，因此B构象的DNA中存在Z-DNA构象是可能的。现已证明Z-DNA参与基因调节-控制基因的启闭。因为Z-DNA的形成，使局部DNA双链处于不稳定状态，这就有利于DNA双链解开，而DNA解链是DNA复制和转录的必要环节。Rich小组利用Z-DNA抗体，证实在DNA调节基因转录的区域中存在Z-DNA(一个DNA短的片段)，并发现这种短的片段既能增强基因的活性，亦能抑制附近基因的活化，这主要取决于环境的不同。在细胞分裂过程中，Z-DNA可能还参与基因的重组。另外，由于Z-DNA分子中大沟消失，小沟深而狭，含有更多的遗传信息，也可能通过蛋白的不同识别方式，来调节细胞的多种生命活动。3、DNA的三螺旋结构1957年，A.Rich等用两条多聚尿嘧啶核苷酸链和一条多聚腺嘌呤核苷酸链合成出一种三链结构的物质，并提出了DNA三螺旋结构的概念。近年来对于DNA三螺旋结构和功能的研究已经取得了很大的进展。DNA的三螺旋结构与双螺旋结构相似，都是通过DNA单链之间形成氢键实现的。H-DNA是一个分子内的三螺旋结构，链上含有较长的多聚嘌呤-多聚嘧啶的DNA序列，在低pH值条件下会形成H-DNA。在这个结构中，富含嘧啶的链与其互补的链部分解离，然后平行地结合在Watson-Crick双链的大沟中。一般认为这种结构在基因的表达中对转录的控制有一定的作用。另外人工合成的多聚核苷酸和寡核苷酸也形成这种类似结构。体外实验表明,三螺旋DNA的形成阻碍了由DNA聚合酶催化的DNA的合成,抑制了基因的表达。DNA三螺旋结构的特点1）组成三螺旋的DNA单链，一般都是由单一的嘌呤碱基（A和G）或单一的嘧啶碱基（C和T）所组成。（2）DNA三螺旋的基本结构有两种，一种是由两条多聚嘧啶碱基核苷酸链和一条多聚嘌呤碱基核苷酸链组成，即嘧啶-嘌呤-嘧啶。三条链中碱基形成氢键的情况是：T-A-T,C-G-C。第二种是由两条多聚嘌呤碱基核苷酸链和一条多聚嘧啶碱基核苷酸链组成，简单表示为嘌呤-嘌呤-嘧啶。三条链中碱基形成氢键的情况是：A-A-T，G-G-C。上述两种结构中，中间的碱基必须是嘌呤碱基。（3）每一条单链至少由8个核苷酸组成。DNA三螺旋结构的三种示意图4、G-四链体G-DNA是四链的核酸，在金属阳离子的参与下形成的一个独特结构。最早有关四链结构的数据是在1992年通过对富含鸟嘌呤的DNA序列进行x射线晶体衍射和NMR研究得到的。人们发现在染色体端粒末端以及一些重要的肿瘤基因转录调节区，具有这种特殊的结构序列。因为肿瘤基因表达的端粒维持机制和转录调节已成为肿瘤药物设计的重要靶点，所以G-四链体结构有可能成为抗肿瘤药物的新靶点。G-四链体DNA由堆积的G-四分体组成，而每个四分体则由4个鸟嘌呤以环状氢键作用平面互联构成。一价阳离子如K+或Na+能稳定G-四链体，推测其可能是通过与四分体中8个羰基氧原子的相互作用所致。现已发现，体外存在着几种G-四链体结构，根据它们的分子特性及螺旋取向，G-四链体可分为如下几类：①含有鸟嘌呤重复序列的4个TTAGGG单链所形成的分子间四链体[即平行型四链体]；②含有两个或多个鸟嘌呤重复序列[(TTAGGG)n，n2]的DNA可形成G-G发夹型(hairpin)，接着双分子化构成几种稳定的双分子四链体结构；③具有4个或更长的鸟嘌呤重复序列[(TTAGGG)n，n≥2]可以自身折叠形成分子内的四链体结构[即自身折叠型(foldover)四链体。i-motif（C-四链体）四链核酸结构除了G-四链体,还包括C-四链体(i-motif).胞嘧啶C在低pH时发生质子化生成胞嘧啶C+,C+一定程度上与G相似,与C形成三组氢键的C•C+配对.体外研究发现,富含C的寡核苷酸片段容易发生部分质子化,C与C+发生配对形成平行的双链结构,两条双链之间通过C•C+反向互相识别,从而形成了一种新的四链结构称为i-motif结构。i-motif结构可由富含C的单分子DNA序列反复折叠、折叠的双分子序列或四个单分子序列的相互作用形成。一些蛋白能够选择性地和这种四链结构结合，因此C-四链体的研究具有重要的生物学意义。G-四链体可能的生物学作用尽管含有G重复序列的DNA在体外Na+或K+的生理浓度下，可以很容易形成G-四链体结构，但在体内G-四链体的形成可能要复杂得多。首先是含重复G碱基的基因组在细胞周期中通过碱基配对形成稳定的双链螺旋结构；其次，在体内DNA通常与特异或非特一性蛋白质结合在一起；再者，体外分子间G-四链体的形成需要较高的DNA浓度，这在体内不可能实现，况且在体内G-四链体的形成可能不需要如此高的DNA浓度。G-四链体可能为一正常结构，其在细胞内可自行聚集和解聚。由于在复制、重组、转录和端粒DNA延长过程中，双链DNA在细胞内会短暂地分离为单链，因此为富含G的DNA链形成G-四链体提供了机会。端粒的保护和延长端粒是真核细胞中线性染色体的特殊末端。由呈串联排列的双链重复亚单位DNA片断和一段单链富含G重复亚单位(TTAGGG)的突出及端粒结合蛋白所构成。为避免端粒的降解、端端融合、重排和丢失而引起基因不稳定和细胞衰老，维持单链突出的完整性是细胞存活所必须的，而G-四链体的形成提供了保护3′-末端突出的可能的分子机制。其可能的机制是，端粒DNA短暂地形成自身折叠型G-四链体结构，从而提供牵引力以置换及帮助DNA底物和RNA模板所形成的碱基对向后移动一个重复序列；其后，在端粒DNA和RNA重新配对进行下一个延长循环前，G-四链体又解聚为一单链。端粒DNA含有许多短的重复序列，这种富含G的核酸链有一段突出的单链，G-四链在这里形成。正常的体细胞在连续不断的细胞分裂循环中会逐渐丢失端粒的重复序列，最终导致细胞死亡。这个过程被端粒酶补偿。端粒酶是一种逆转录酶，它用于延长端粒DNA的3’-末端。在正常的体细胞中端粒酶不被激活，相反80％-90％的肿瘤细胞都表现出端粒酶的活性。端粒酶维持端粒的长度，从而也维持了细胞分裂的能力。端粒酶在肿瘤细胞中高度表达，被作为很有前景的癌症治疗靶标。转录调节某些重要基因的启动区，例如人或鸡β-珠蛋白基因、兔前胰岛素原II基因、腺病毒血清型2、视网膜神经蚀质瘤敏感性基因和c-Myc基因中，皆发现有富含G的重复序列，因此它们都具有形成G-四链体结构的可能性；通过查找基因数据库，发现其他一些肿瘤基因启动区也具有富含G的重复序列。这些发现促使研究人员推测G-四链体在基因转录调节过程中起一定作用。另外，G-四链体能阻断RNA聚合酶。因此当基因密码区的富含G重复序列形成G-四链体，而又不易解聚时，可能会起到抑制RNA聚合酶的作用，从而引起早期转录的停止。5，DNA的超螺旋结构超螺旋（Supercoil），简单地说就是螺旋的螺旋。超螺旋的形成不是一个随机过程，而是当DNA存在一定张力时才会形成。由于DNA双螺旋的盘绕过度或不足，使DNA分子处于一种张力状态，在封闭环状DNA分子中的这种张力不能释放出来，就会形成超螺旋。超螺旋的形式中心轴的盘绕同双螺旋两条链盘绕的方向相反，称为负超螺旋。负超螺旋能让DNA分子通过调整双螺旋本身的结构来减少这种张力。一般是减少每个碱基对的旋转，即放松两股链彼此的盘绕，所以把具有负超螺旋的DNA称为盘绕不足DNA。如果