环境微生物学教案-—微生物学基础

第一篇微生物学基础第一章非细胞结构的超微生物——病毒病毒的发现1886年，德国农业化学家迈尔在荷兰的接种试验(烟草花叶病是一种传染性疾病)病毒：没有细胞结构、转性寄生在活的敏感宿主体内的超微小微生物。•由于病毒特殊的结构和形态及其生活习性，按照六界学说，把病毒列为单独的一个界，即病毒界。病毒个体极小（0.2µ），只有在电子显微镜下才能看见病毒的庐山真面目，而且病毒不具有细胞结构。第一节病毒的一般特征及分类病毒是•超显微的大分子生物•无细胞结构•只含一种核酸（RNA或DNA）•专性活细胞内寄生•体外可以无生命状态存在且保持其侵染性特点：•小•可通过细菌滤器•成分：一种核酸+蛋白质•缺乏酶类、无核糖体、无蛋白质合成系统•专性活细胞内寄生•可结晶，且可在外界长期保存•特殊的繁殖方式：复制+装配•对干扰素敏感，对抗生素不敏感病毒的分类：病毒有自己单独的分类系统，其分类依据主要有：病毒的宿主、所致疾病、核酸种类、病毒粒子的大小、病毒的结构、有无被膜等。•根据病毒不同的专性宿主，可把病毒分为：动物病毒、植物病毒、细菌病毒（噬菌体）、放线菌病毒（噬放线菌体）、藻类病毒（噬藻类体）、真菌病毒（噬真菌体）•也可以按照所致的疾病进行分类•按核酸分类，可把病毒分为：DNA病毒和RNA病毒。类病毒和阮病毒：类病毒：比病毒更加小的致病感染因子。一般通过分子内碱基配对以棒状闭合环状分子形式存在。阮病毒：是一种引起牛、羊疾病的感染因子（蛋白样感染颗粒）。病毒中没有检测到核酸存在。可导致退化性神经系统紊乱疾病。3、蝌蚪状(噬菌体)图6-2病毒的各种形态形态1、杆状或丝状(大多为植物病毒)2、多面体或球形(大多为动物、真菌病毒)第二节病毒的大小和形态“非典型肺炎”元凶冠状病毒SARS“非典型肺炎”元凶冠状病毒SARS武汉病毒研究所观察到的冠状病毒样颗粒显微镜下被SARS病毒感染的人体细胞图6-1病毒和细菌的相对大小支原体痘病毒疱疹病毒流感病毒1μ葡萄球菌细小核糖核酸病毒最大的病毒与最小的病毒天花病毒200×300nm脊髓灰质炎病毒口蹄疫病毒10nm蛋白质是病毒的主要组成成分。例如，流感病毒核酸的含量仅为1%，烟草花叶病毒核酸的含量为5%。蛋白质的主要作用：①构成病毒粒子的外壳，保护病毒核酸。②决定病毒感染的特异性，与易感细胞表面存在的受体有特异性亲和力。③具有抗原性，能刺激机体产生相应的抗体。病毒的组成成分：蛋白质+核酸+类脂质、多糖病毒的结构图6-3病毒的粒子的基本结构病毒粒子：成熟的或结构完整，有感染性的病毒个体。壳体核酸包膜刺突核壳体衣壳粒子是由一种或几种多肽链折叠而成的蛋白质亚单位，它们以对称的形式有规律的排列，构成病毒的蛋白质外壳—衣壳。•核酸内芯一般有两种：即：RNA和DNA•一个病毒粒子不能同时含有RNA和DNA，而只含有其中一种。•动物病毒有的含RNA，有的含DNA•植物病毒大多数含RNA，少数含DNA•噬菌体大多数含DNA，少数含RNA•二十面体对称的结构(球状)•螺旋对称的结构(杆状)•复合对称的结构(蝌蚪状)典型的病毒粒子的形态：三种对称性构型（重点）2构型(1)烟草花叶病毒(TMV)---螺旋对称衣壳衣壳蛋白：占95%，2130个衣壳粒核心RNA：占5%，ssRNA300nm÷2.3nm/圈=130圈130圈×161/3个/圈=2130(2)腺病毒(ADENOVIRUS)---二十面体立体对称•1953年发现形状：二十面体腺质体致病性：消化道炎症等。12个顶角20个面30个边衣壳：252个衣壳粒12个五邻体，240个六邻体核心：dsDNA，线状(3)T偶噬菌体---复合对称头部尾部目前噬菌体基本形态分为3种蝌蚪形微球形丝状椭圆形20面体衣壳粒212内含DNA和中心蛋白螺旋对称衣壳粒144个注射核酸的通道•裂性噬菌体增殖吸附、侵入、增殖(复制)、装配（聚集）释放病毒的繁殖（重点）---以噬菌体为例1吸附•位点：受体、性菌毛等•过程：随机碰撞、尾丝散开、固着、刺突插入、基板固定•感染复数(multiplicityofinfection)：每一敏感细胞可吸附的相应噬菌体的数量。2侵入•过程：尾丝展开、释放溶菌酶、尾丝尾鞘收缩、DNA注入•细胞外裂解动物病毒借助胞饮作用或直接穿过膜，植物病毒则通过伤口或昆虫刺吸传染3增殖•核酸复制•核酸转录•蛋白质合成DNA病毒(poxvirus)的复制4装配DNA分子的缩合通过衣壳包裹DNA而形成头部尾丝和尾部其它部件独立装配完成头部与尾部相结合装上尾丝•成熟的病毒粒子从被感染细胞内转移到外界的过程。•没有包膜的病毒合成溶解细胞的酶，引起内裂解。•有包膜的病毒以下图方式进行：5释放•噬菌体有毒（烈）性噬菌体和温和噬菌体两种类型。毒（烈）性噬菌体，侵入宿主细胞后立即引起宿主细胞破裂。温和噬菌体：侵入宿主细胞后，其核酸附着并整合在宿主染色体上，和其一起同步复制，宿主细胞不裂解而继续生长。溶源性细菌基本特性：(1)溶源性是溶源性细菌的一个极其稳定的遗传特性(2)自发裂解(3)诱发裂解(4)具“免疫性”(5)溶源性细菌的复愈：非溶源化(6)溶源转变：可获得一些新的生理特性溶源性细菌：含有原噬菌体(温和噬菌体)的细菌称为溶源性细菌。1、噬菌体可以作为防治某些疾病的特效药，例如烧伤病人在患处涂抹绿浓杆菌噬菌体稀释液2、在细胞工程中，某些病毒可以作为细胞融合的助融剂，例如仙台病毒3、在基因工程中，病毒可以作为目的基因的载体，使之被拼接在目标细胞的染色体上4、在专一的细菌培养基中添加的病毒可以除杂5、病毒可以作为精确制导药物的载体6、病毒可以作为特效杀虫剂7、病毒可以作为生化武器病毒的作用第四节病毒的培养1.病毒在液体培养基中的培养特征1）敏感细胞接种，培养后培养液变浑浊；2）接种病毒（噬菌体）；培养液透明。2.病毒在固体培养基中的培养特征1）敏感细胞接种，形成菌落；2）接种病毒（噬菌体）；3）培养基上出现空斑（噬菌斑）见图1-8。一、病毒的培养特征（重点）对培养基的要求苛刻。其敏感细胞必须具备的条件：1）必须是活的敏感动物或敏感动物的组织细胞；2）能提供病毒附着的受体；3）敏感细胞内不能具有限制性核酸内切酶，病毒进入后可以生长繁殖。二、病毒的培养基动物病毒培养基；植物病毒培养基；噬菌体培养基。（一）动物病毒的培养方法1）动物接种：应用很少2）鸡胚接种：常用于流感病毒3）组织培养接种：应用广泛三、病毒的培养2）.动物病毒的采集与制备固体：配成悬液，离心10min（104r/min），取上清夜，备用。液体：离心10min（104r/min），取上清夜，备用。空气：空气泵抽送或直接暴露在空气中。1）.单层细胞的制备和培养：先用无菌小刀切成0.5～1.0mm3的小块，用平衡盐水洗涤，再用胰酶消化10～15min，将细胞间的“间质蛋白”水解，细胞分散。计算个数，加入生长液，培养（37℃，2～3d）成单层细胞，备用。1.动物病毒空斑试验实验步骤：3）.动物病毒的接种：将病毒样品接种到单层细菌培养基上，适当条件的培养，直到空斑的出现。1.动物病毒培养实验步骤：2.系列稀释终点终点或滴度和CPE（细菌病理效应）TCLD50：培养管细菌产生CPE的病毒的剂量；ID50：50％动物被感染剂量；LD50：50％动物死亡的剂量。第五节病毒对物理、化学环境因素的抵抗力物理因素化学因素一、病毒对物理因素的抵抗力（重点）1.温度1）高温对病毒具有灭活功能原因：高温破坏病毒的蛋白质和核酸，其中蛋白质的灭活速度快。蛋白质变性后影响对宿主的吸附能力，消弱了病毒的感染力。2）低温不会灭活病毒，通常在-75℃保存病毒。温度光干燥一、病毒对物理因素的抵抗力2.光及其他辐射1）紫外辐射紫外线对病毒具有灭活功能。原因：破坏病毒的核酸，使核酸的嘧啶受到影响，形成胸腺嘧啶二聚体。(即在相邻的胸腺嘧啶残基之间形成共价键)2）可见光在氧气和染料条件下，肠病毒对可见光敏感而被杀死，称为“光灭活作用”。原因：染料附着核酸上，催化光的氧化过程，引起病毒死亡。病毒对物理因素的抵抗力3.干燥干燥是控制病毒的重要条件。如：相对湿度（RH）越低，病毒的存活时间越短。当土壤的水分低于10％时，病毒会迅速灭活。干燥灭活原因：使病毒成分的解离和核酸的降解。二、病毒对化学因素的抵抗力化学物质对病毒的灭活有：体内灭活和体外灭活两种。1.体内灭活的化学物质有抗体和干扰素。抗体:病毒入侵后，体内会产生特异蛋白质，用于抵抗病毒。入侵的病毒为抗原，产生的蛋白质为抗体。干扰素：病毒入侵后，体内会产生一种糖蛋白质，它可以诱导宿主产生抗病毒的蛋白质对病毒灭活，干扰素起的是间接作用。二、病毒对化学因素的抵抗力2.体外灭活的化学物质酚、甲醛、醚、氨、氯（化合物）、溴、碘、乙醇、氯仿、强酸、强碱、氧化剂等。1）破坏病毒蛋白质的物质酚及低缓冲溶液2）破坏病毒核酸的物质甲醛、氨3）破坏病毒被膜的物质含脂类物质对醚、氯仿敏感，可以鉴别。病毒的存活和在污水处理中的去除效果环境中存在的各种因子会影响到病毒的生存，所以病毒在各种不同环境中的存活时间是不一样的。污水处理的不同程度，对病毒的去除效果也是不同的。一级处理：很低，最多30%二级处理：90-99%三级处理：进一步减少•作业：•P29•1、3、4、5、12、14