酵母双杂交ppt

酵母双杂交技术酵母双杂交系统的基本原理酵母和其它真核生物中,转录调控蛋白通常由2个独立的结构域组成:DNA结合区(Bindingdomain,BD)：结合UAS转录激活区(Activationdomain,AD)：激活转录这两个功能区是很容易分开的,可以将一种蛋白质的DNA结合区与另一个蛋白质的转录激活区融合,组成一个有活性的杂合蛋白UAS(upstreamactivationsequence)activationdomainDNAbindingdomaintranscriptionmachinerygene酵母双杂交系统组成•与BD融合的蛋白表达载体，被表达的蛋白称诱饵蛋白(bait)•与AD融合的蛋白表达载体，被表达的蛋白称靶蛋白(prey)•带有一个或多个报告基因的宿主菌株常用系统：LexA系统LexA：作为一个DNA-BD结合lexA操纵子。AD是已克隆到特定载体的异源基因。诱饵蛋白与DNA-BD融合，靶蛋白与AD融合，若两融合蛋白结合即产生一个新的转录因子，其可识别并结合lexA操纵子的特异位点，调控报告基因表达。LexA系统使用的报告基因：lacZ，LEU2XGAL4DNA-BDGAL1UASpromoterlacZ(orHIS3etc)reportergeneGAL4ADYPromoteractivationGal4系统Gal4蛋白：酵母菌的转录因子，含有DNA-BD和AD两个部分。DNA-BD与诱饵蛋白基因X结合，构建BD-X融合表达载体，DNA-AD与靶蛋白Y结合，构建AD-Y表达载体。两个载体共转化至酵母细胞内，若X和Y互作，BD和AD空间上接近，激活UAS下游启动子调节的报告基因表达。酵母菌株MATCHMAKERGAILTwo-HybridSystem3双杂交系统质粒实验流程诱饵质粒的构建及表达cDNA文库的构建和鉴定(猎物载体的构建和表达)酵母双杂交筛选单个文库质粒的自激活检测和阳性克隆的进一步确定阳性克隆的测序分析β-半乳糖苷酶活性定量分析诱饵质粒的构建及表达•诱饵质粒的构建•重组质粒转化酵母菌株：醋酸锂法•融合蛋白表达的检测酵母菌体蛋白抽提WesternBlotting鉴定•内源性His3蛋白表达抑制检测某些诱饵质粒转化酵母菌后会诱导产生内源性组氨酸3-氨基-1，2，4-三唑（3-AT）：抑制内源性组氨酸产生通过在培养基中加入3-AT抑制内源性组氨酸产生选择最佳3-AT浓度，抑制背景表达:诱饵质粒与AD空载体转化酵母菌，涂布于3-AT浓度梯度的SD培养基上，观察菌落生长情况cDNA文库的构建和鉴定mRNA的制备合成cDNA第一链cDNA的LD-PCR的扩增连接到克隆载体中转化大肠杆菌文库质量检测一个具有良好代表性cDNA文库应具有106以上的库容量文库滴度（pfu/mL）定义为：菌斑数×稀释倍数×1000/铺入平板的稀释的菌溶液体积（μL）cDNA插入片断的分析鉴定酵母双杂交筛选单个文库质粒的自激活检测和阳性克隆的进一步确定1、AD质粒和BD质粒的分离提取阳性克隆的质粒转化到感受态细胞DH5α，涂布于含Amp的LB平板上2、单个AD质粒自激活检测挑取含Amp的LB平板上生长的单菌落培养，提取质粒DNA，同BD空载体共转化酵母菌株，涂布于相应SD平板上3、确认阳性互作将无自激活的单个文库质粒和诱饵质粒共转化酵母菌株，涂布于相应SD平板上阳性克隆的测序分析将已验证为阳性克隆的AD质粒测序，通过BLAST进行核酸序列同源性分析β-半乳糖苷酶活性定量分析阳性克隆SD-2中30℃培养过夜NA2CO3终止反应转接YPAD培养至OD600=1.0-1.5ZBuffer洗涤液氮中冻融3次加入底物硝基苯半乳糖（ONPG），30℃显色取上清，测定420nm下OD值β-半乳糖苷酶活性=1000×OD420/（t×V×OD600）酵母双杂交系统的应用验证通过其他方法发现的蛋白质间可能的相互作用确定蛋白质特异相互作用的关键结构域和氨基酸筛选文库以得到与已知蛋白质存在特异相互作用的蛋白质FunctionsofOsBZR1and14-3-3proteinsinbrassinosteroidsignalinginricePNAS2007,104(34):13839–13844BDADGal4Gal4reporterfull-lengthOsBZR1aricecDNAlibrarySequencesoftheputative14-3-3bindingsiteinOsBZR1anditsmutagenizedversionS156G.InteractionbetweenOsBZR1andGF14cinyeasttwo-hybridassaysThreeclonesofyeastcontainingeachcombinationofbait(BD)andprey(AD)vectorsweregrownoncompletemedium（+Ade）orAdedrop-outselectionmedium(+Ade).AD-T7,pGAD-T7emptyvectorwasusedasanegativecontrol.Mutationofthe14-3-3bindingsiteofOsBZR1enhancesthereportergeneexpressioninyeast.TheyeastcontainingGAL4BD-OsBZR1,GAL4BD-OsBZR1S156G,andGAL4BDemptyvectorswereinoculated,with10-folddilutions,onto-Trpand-Trp/Hisdrop-outmedawithdifferent3-amino-1,2,4-triazoleconcentrationsandculturedfor4days.OsBZR1istranscriptionallyactiveinyeastInteractionwithyeast14-3-3proteinsinhibitsthetranscriptionalactivityofOsBZR1inyeastcells传统酵母双杂交系统自身问题和缺陷•并非对所有的蛋白质适用融合蛋白的相互作用激活报告墓因是在细胞核内发生的，所以表达的融合蛋白在细胞内能否正确折叠并被运至核内是检测蛋白之间有否相互作用的前提条件不能被转运到细胞核内的蛋白质如细胞桨蛋白、细胞膜蛋白的相互作用就不易使用该系统•假阳性的发生频率较高