CAP-CTM-HIV-version-2.0试剂盒说明书

05212294190V.1.01/31人类免疫缺陷病毒(I型)核酸定量检测试剂盒(PCR-荧光法)说明书【产品名称】通用名称：人类免疫缺陷病毒(I型)核酸定量检测试剂盒(PCR-荧光法)人类免疫缺陷病毒(I型)核酸定量检测试剂盒(PCR-荧光法)COBAS®AmpliPrep/COBAS®TaqMan®洗涤试剂英文名称：COBAS®AmpliPrep/COBAS®TaqMan®HIV-1Test,version2.0COBAS®AmpliPrep/COBAS®TaqMan®HIV-1Test,version2.0COBAS®AmpliPrep/COBAS®TaqMan®WashReagent【包装规格】48测试；5.1升【预期用途】人类免疫缺陷病毒(I型)核酸定量检测试剂盒(PCR-荧光法)2.0版为体外核酸扩增测试，使用COBAS®AmpliPrep仪器自动处理样品，使用COBAS®TaqMan®分析仪或者COBAS®TaqMan®48分析仪自动扩增、定量检测人血浆中HIV-1RNA。其定量检测HIV-1RNA的动态范围为20～10000000拷贝/mL。根据基于核酸技术(NIBSC97/656)1的HIV-1RNAWHO第1国际标准，1拷贝HIV-1RNA相当于1.7±0.1国际单位(IU)。本方法针对HIV-1感染病人的临床管理，应结合临床表征以及疾病进展中的其他实验室标记物。通过测定HIV-1RNA水平的基线，对患者的预后举行评价；或者在抗病毒治疗过程中通过测定EDTA处理的血浆中HIV-1RNA水平的变化，监控抗病毒治疗的效果。人类免疫缺陷病毒(I型)核酸定量检测试剂盒(PCR-荧光法)(v2.0)不能作为判定血液或者血液制品中HIV-1是否存在的筛查试验，该方法也不能用于确认HIV-1感染是否存在。注：与COBAS®AMPLICORHIV-1MONITOR检测(v1.5)和人类免疫缺陷病毒(I型)核酸定量检测试剂盒(PCR-荧光法)HIV-1检测相比，人类免疫缺陷病毒(I型)核酸定量检测试剂盒(PCR-荧光法)(v2.0)敏感度更高,报告值≥20cp/mL(不可检测)或低于这些方法中的定量下限(LLoQ)。【临床意义】人类免疫缺陷病毒(HIV)是获得性免疫缺陷综合症(AIDS)的致病因子，主要通过性接触、血液感染、血液制品感染或母婴传播2-4。病人一旦感染该病毒，HIV-1RNA定量测定就成为疾病评估和抗逆转录病毒疗法检测的关键工具。多个研究已经证实了高病毒水平和HIV相关疾病的临床进展风险有正向关系，而血浆内病毒水平的降低可以减低这种风险5-7。抗逆转录病毒疗法中病毒量监测的临床效用已经经多个临床药物试验确定8,-9。成功治疗的关键病毒端点包括一定时间内的病毒量减少等级(log10单位)、在关键时间处于监测限值之下时患者表现出的病毒抑制程度百分比和最后时刻的病毒学反应(抗性或非依附性)8,-9。在对该疗法有反应的患者中，已预计到存在一种CD4细胞计数的增加与病毒抑制有关。该端点已被选入了所有主要的美国和全球HIV治疗指导准则之中10-13。已建立起了特定的HIV-1RNA水平医疗决策点以用于启用抗逆转录病毒疗法、确定治疗反应度、病毒量监测频率以及决定病毒失败10-13。总之，HIV-1RNA水平定量监测依然是抗逆转录病毒反应最重要的替代标记物。外周血液病毒水平可由血清内HIVp24抗原测定定量测出，或由血浆HIV定量培养得出，或使用核酸扩增或信号放大技术直接对血浆中病毒RNA进行测定14-19。最初的病毒RNA定量测定使用了针对PCR或核酸扩增反应的端点测量15,18。PCR终点检测阶段需在扩增后进行并且存在局限，包括线性范围有限，耗费时间长19。实时目标扩增系统工具的引入使得扩增和检测可以同时进行，有效改善了终点扩增的局限性17-19。实时PCR技术的优势在于增强了敏感度、线性范围更宽以及由于反应时间缩短，从而减少了回转处理时间19。最近，对HIV基因多样性认识的逐步提高凸显了进一步发展新一代实时扩增测试的重要性20。为了突出突变逃逸的风险，使用了一种新的PCR设计(双目标方法)对HIV-1的两处目标区域进05212294190V.1.02/31行了共扩增。人类免疫缺陷病毒(I型)核酸定量检测试剂盒(PCR-荧光法)HIV-1检测(v2.0)是一种胞外核酸扩增测试，能够对所有HIV-1M组和O组的亚型进行定量测定。将来自HIV-1长末端重复的三个引子和一个探针以及来自gag区的四个引子和一个探针作为目标区域并对该区域进行扩增。Gag区和LTR区在系统发育上均高度保守，能够保证覆盖范围广泛的亚型。【检验原理】人类免疫缺陷病毒(I型)核酸定量检测试剂盒(PCR-荧光法)HIV-1v2.0检测采用核酸扩增技术，定量检测人血浆中HIV-1RNA。该方法包括三个主要步骤：⑴样品制备以分离HIV-1RNA；⑵RNA靶的逆转录形成cDNA；⑶靶cDNA的PCR扩增以及裂解的、靶特异性的、双标记寡核苷酸探针的检测。同时，该方法允许自动样品制备后自动完成逆转录、PCR扩增以及靶HIV-1RNA和HIV-1标准(QS)带盔甲RNA的检测。MasterMix试剂含有HIV-1RNA和HIV-1QSRNA特异的引物和探针，并确保能定量不同亚型的M型HIV-1RNA和O组HIV-1。检测扩增的DNA时，利用靶特异的和QS特异的双标记寡核苷酸探针，允许独立区分HIV-1扩增子和HIV-1QS扩增子。利用HIV-1QS完成HIV-1RNA的定量检测。HIV-1QS的运用可以补偿抑制效应、控制样品制备和扩增过程，以便对每一样品进行更准确的定量。HIV-1QS为非感染性带盔甲RNA结构，该结构含有与HIV-1RNA靶相同的引物结合位点和特殊的探针结合区，以区别HIV-1RNA扩增子和HIV-1QS扩增子。已知拷贝数的HIV-1QS加入到每一样品中，与样品同时完成样品制备、逆转录、PCR扩增以及双标记寡核苷酸探针的裂解、检测步骤。通过比较每一样品和对照中HIV-1信号和HIV-1QS信号，COBAS®TaqMan®分析仪或者COBAS®TaqMan®48分析仪自动计算HIV-1RNA的浓度。靶位选择HIV-1RNA靶序列的选择取决于已鉴定的HIV-1基因组中不同亚型的M群和O群HIV-1RNA的最保守的序列。为了针对病毒的高度基因变异，用COBAS®AmpliPrep/COBAS®TaqMan®HIV-1检测，v2.0对HIV基因组的两个区同时扩增检测。两个靶特异的和一个QS特异的双标记寡核苷酸探针可以独立区分HIV-1扩增子和HIV-1QS扩增子。因此，选择合适的引物和双标记的寡核苷酸探针对于获得M组HIV-1亚型和O组HIV-1的扩增和检测能力至关重要。人类免疫缺陷病毒(I型)核酸定量检测试剂盒(PCR-荧光法)HIV-1v2.0检测中，逆转录和PCR扩增所用的引物位于高度保守的HIV-1gag基因和HIV-1的LTR区域20。样品制备采用非专利的二氧化硅捕获技术，人类免疫缺陷病毒(I型)核酸定量检测试剂盒(PCR-荧光法)HIV-1，v2.0检测的AmpliPrep仪器可以自动制备样品。该程序可以处理850μL血浆样品。在稍高的温度下，蛋白酶和裂解液/结合缓冲液与样品孵育，裂解HIV-1病毒颗粒，释放出核酸，并保护HIV-1RNA免受血浆中RNA酶的破坏。蛋白酶和已知拷贝数的HIV-1QS带盔甲RNA与裂解试剂和磁性玻璃珠一起加入到每一样品中。混合物经孵育后，HIV-1RNA和HIV-1QSRNA结合于磁性玻璃珠表面。未结合的一些物质，如盐、蛋白质及其他的细胞杂质经洗涤磁性玻璃珠后被除去。经磁性玻璃珠的分离和完全的洗涤步骤，吸附的核酸在较高的温度下洗脱下来。样品处理后释放出来的HIV-1RNA及HIV-1QSRNA被加入至扩增混合物中，并被转移至COBAS®TaqMan®分析仪或者COBAS®TaqMan®48分析仪。HIV-1靶RNA及HIV-1QSRNA随之进行逆转录、扩增，并经切除靶特异的和QS特异的双标记寡核苷酸探针完成实时定量检测。逆转录和PCR扩增逆转录和PCR扩增使用热稳定的、重组的嗜热菌DNA聚合酶Z05。在Mn2＋存在条件下，适宜的缓冲液中，Z05具有逆转录酶和DNA聚合酶活性22，23，从而允许逆转录及PCR扩增与实时检测扩增子一起进行。处理后的样品加入至扩增管(K-tubes)的扩增混合物中，进行逆转录和PCR扩增。经加热后退火，下游引物与HIV-1靶RNA及HIV-1QSRNA特异结合。在Mn2＋及过量dNTPs(包括dATP、dGTP、dCTP、dTTP和dUTP)存在条件下，Z05延伸退火后的引物，形成与RNA靶互补的DNA链。靶扩增将处理好的样品加入到装有扩增混合物的扩增管(K管)中。HIV-1靶RNA及HIV-1QSRNA逆转录后，COBAS®TaqMan®分析仪或者COBAS®TaqMan®48分析仪中的热循环仪加热反应05212294190V.1.03/31混合物使RNA：DNA杂交物变性，暴露特异的引物靶序列。反应混合物冷却后，引物与靶DNA退火。在Mn2及过量dNTPs(包括dATP、dGTP、dCTP、dTTP和dUTP)存在的条件下，Z05DNA聚合酶沿靶DNA模版延伸退火后的引物，形成双链DNA(1个扩增子)。COBAS®TaqMan®分析仪或者COBAS®TaqMan®48分析仪自动重复此过程，完成已设定的循环次数，每完成一次循环，DNA扩增子的数目加倍。循环次数已预编程至COBAS®TaqMan®分析仪或者COBAS®TaqMan®48分析仪。扩增仅仅发生于HIV-1基因组上引物之间的两个区段，完整的HIV-1基因组并不扩增。选择性扩增人类免疫缺陷病毒(I型)核酸定量检测试剂盒(PCR-荧光法)HIV-1检测通过利用AmpErase酶(UNG)和dUTP，样品的靶核酸被选择性扩增。AmpErase酶识别并催化对含dU(而非含dT的DNA链)的DNA链结构破坏作用24。通常dU并不存在于天然DNA，但当反应混合物试剂中dUTP作为dNTPs之一时，dUTP会存在于扩增子；因此，只有当扩增子含有dU时，该扩增子相对于靶扩增而言，更易发生由AmpErase酶引起的DNA结构破坏。同时，任何由锰激活产生的非特异性产物都可以被AmpErase酶破坏。MasterMix试剂中存在的AmpErase酶通过开放dU残基的脱氧核糖C1位，催化含dU的DNA的切除反应。在热循环的第一次循环的加热过程中，DNA扩增子在dU处中断，使得该DNA不能被扩增。在延伸期乃至热循环的整个过程中，一旦温度超过55℃，AmpErase酶将不具有活性，从而就不能破坏PCR形成的扩增子。COBAS®TaqMan®检测中PCR产物检测人类免疫缺陷病毒(I型)核酸定量检测试剂盒(PCR-荧光法)HIV-1检测v2.0采用实时定量25-26PCR技术。使用双标记的荧光探针，通过监控扩增过程中荧光报告基团发出的荧光强度，实时定量检测PCR产物的积累。HIV-1及HIV-1QS特异的寡核苷酸探针携带有荧光报告基团和淬灭基团。本方法中，HIV-1及HIV-1QS特异的寡核苷酸探针标记有不同的荧光基团。当探针为完整时，荧光报告基团接近淬灭基团，由于Förster能量转移效应，荧光被抑制。PCR过程中，探针与靶序列杂交，并为Z05DNA聚合酶的5’3’核酸酶活性切割。一旦荧光报告基团和淬灭基团解离，淬灭作用不再发生，报告基团的荧光活性升高。HIV-1RNA和HIV-1QSRNA的扩增在两个不同的波长独立完成检测。此过程完成预设定的循环次数的重复，每一次有效的循环均会升高单个报告基团的荧光发散强度，独立检测HIV-1RNA和HIV-1QSRNA。生长曲线开始指数生长时的PCR循环与PCR开始时的起始原料有关。COBAS®TaqMan®定量检测的基本原理人类免疫缺陷病毒(I型)核酸定量检测试剂盒(PCR-荧光法)HIV-1检测v2