3.荧光探针

1荧光探针朱23内容提要•探针的分类•探针的应用•探针的选择4动物细胞结构示意图5荧光探针的分类¾按照荧光探针制作方式¾化学荧光探针:化学方法合成的¾基因荧光探针:可遗传、由DNA编码、蛋白质组成的¾按照荧光探针功能来分¾…….6¾绿色荧光蛋白GreenFluorescenceProtein¾最早，绿色荧光蛋白（GFP）是由Shimomura等人在研究水母发光蛋白时发现的，水母发光蛋白是从水母Aequorea中得到的一种有生物活性发光蛋白质。荧光基因探针基因荧光探针7绿色荧光蛋白的生物化学特征¾238个氨基酸组成。¾吸收峰395nm发射波长508nm¾稳定性：65℃、pH11、1%SDS、6mol/L盐酸胍，或蛋白酶处理几小时，仍然保持荧光活性。基因荧光探针8绿色荧光蛋白的发光机制¾成环反应¾氧化A基因荧光探针9光异构化和光漂白基因荧光探针10突变和光谱变化¾根据荧光基团组成：野生型、酚阴离子型(GFP-S65T)、中性酚型(Sapphire)、YFP、CFP、BFP、苯基型¾颜色：蓝色BFP、青蓝色CFP、绿色GFP、黄色YFP基因荧光探针11（引自Cubitt,A.B.,1999）基因荧光探针12按荧光探针功能分类•细胞活性探针•细胞器探针•Ph值探针•免疫荧光探针•……13细胞活性探针•标记活细胞；酯酶底物探针、过氧化物酶底物探针和离子泵活性指示探针•识别死细胞：死细胞探针有膜不透性DNA探针和丹磺酰赖氨酸。•优点：灵敏，安全。•其他方法：比色法、同位素示踪法。化学荧光探针14正常凋亡坏死形态特征形态正常细胞皱缩、凋亡小体溶解胞膜保持完整性保持完整性丧失完整性细胞核均匀，疏松致密、浓缩、染色质聚边不规则碎裂，溶解DNA完整，无断裂被非随机切成180bp片段无规则断裂细胞器完整，无崩解完整，无崩解肿胀，崩解结局正常形成凋亡小体被邻近细胞吞噬，不引起炎症反应细胞崩解，引起炎症反应诱发因素无刺激生理或非生理性刺激非生理性刺激潜伏期数小时无酶涉及酶激活及酶促反应不激活蛋白合成新蛋白的合成与表达无能量消耗能量依赖性无与其它细胞关系通常只影响散在单个细胞，组织结构不被破坏涉及多个细胞，组织结构被破坏15细胞器探针¾细胞器探针：与细胞器选择性结合的荧光染料。¾主要用途：研究胞内的氧化作用、有丝分裂、底物降解作用、解毒反应、细胞间的转运和细胞分拣等。化学荧光探针16线粒体¾是负责有氧代谢的细胞器。线粒体的丰度随细胞类型、代谢水平、细胞所处状态的不同而有所差异¾用于标记线粒体活性、定位和丰度，监测药理学试剂的药效化学荧光探针MitoTrackerRedCMXRos(M-7512)17溶酶体¾是一种由单层膜包被的小体，内含各种糖苷酶、酸性磷酸酶、弹性蛋白酶、羧肽酶、蛋白酶、组织蛋白酶及多种蛋白酶。¾大都是利用荧光底物标记水解酶的活性和pH变化来标记的。化学荧光探针LysoTrackerYellowHCK-123(L-12491)LysoTrackerRedDND-99(L-7528)18¾Responsiblefordegrading9certaincellcomponents9materialinternalizedfromtheextracellularenvironment化学荧光探针19溶酶体和线粒体同染化学荧光探针LysoTrackerRedDND-99(L-7528)MitoTrackerGreenFM(M-7514)20内质网¾粗面内质网和滑面内质网¾主要功能：蛋白质的合成、加工、修饰和转运，脂类合成，糖类代谢，解毒作用。化学荧光探针ER-TrackerBlue-WhiteDPX(E-12353)21内质网和线粒体同染化学荧光探针ER-TrackerBlue-WhiteDPX(E-12353)MitoTrackerRedCM-H2XRos(M-7513)22高尔基器¾高尔基器将由粗面内质网运来的蛋白质类物质进行加工、浓缩、储存、运输，最后形成分泌泡排出体外。化学荧光探针Green-fluorescentBODIPYFLC5-ceramidelocalizedtotheGolgiapparatusRed-fluorescentLysoTrackerRedstainaccumulatedinthelysosomesBlue-fluorescentHoechst33258dyestainedthenuclei.23细胞骨架¾细胞形态支撑与形态建成¾细胞内的转运或运动¾膜相差的性质和功能¾吞噬作用¾细胞运动24膜荧光探针¾细胞膜基本成分：磷脂、脂肪酸和固醇，¾膜探针：非极性探针、两性探针、膜流动性探针、荧光标记的磷脂、脂肪酸和固醇探针。¾用途：测量膜的扩散、监测病毒－细胞的融合、观察膜流动性和研究膜表面的分子组成。化学荧光探针DiIC18(3)(DiI;D-282,D-3911)25细胞膜的流动性¾主要方式：侧向扩散、旋转、伸缩振动、翻转、摆动等。¾侧向扩散的测量:荧光光漂白恢复(FRAP)¾旋转扩散的测量:荧光偏振法化学荧光探针26Fluorescencerecoveryafterphotobleaching(FRAP)27核酸探针¾核酸是细胞生长、分化、遗传的重要物质¾用途：测定DNA和RNA的形态和含量；研究细胞周期和肿瘤的诊断、治疗和预防化学荧光探针YOYO-1(Y-3601)28人嗜中性粒细胞核染色化学荧光探针SYTO13live-cellnucleicacidstain(S-7575)29ThecellcycleisanorderedseriesofeventsleadingtothereplicationofcellsG0-G1SG2-MFluorescenceIntensity#ofEvents3031¾快响应探针：响应时间短于1ms；变化幅度：2％～10％/100mV；监测动作电位传播过程中发生的快速变化¾慢响应探针:反应速度较慢，为1～20s；变化幅度:1～2%/1mV膜电位探针化学荧光探针RH414(T-1111)DM-BODIPYdihydropyridine(D-7443)Right:ratioofthemiddleimagedividedbytheleftimage32慢响应探针化学荧光探针33钙离子探针¾定性探针：由单波长激光激发，通过荧光变化直接测量细胞内钙离子动态变化¾定量探针：是双波长激发探针，利用双波长激发和比率技术，来定量测定¾这些探针本生不能透过细胞膜，因而需要使用其AM形式。化学荧光探针34Fluo3¾可见光激发：Ex：490nm，Em：525nm；¾荧光变化最大：增强50－250倍，¾对pH、Mg2＋等相对不敏感；化学荧光探针35化学荧光探针36海星卵受精诱导的钙波（5s）化学荧光探针CalciumGreen-1(C-3713)37pH探针¾正常的情况下，胞浆为pH6.8～7.4，溶酶体为pH4.5～6.0¾胞内pH的影响：细胞代谢、细胞间通讯¾pH探针分为中性和偏酸性，均为疏水性探针中性探针：需使用其AM形式偏酸性探针：细胞胞饮作用进入溶酶体化学荧光探针38活性氧探针¾胞内活性氧影响细胞代谢¾应用：毒理学¾常用荧光探针有H2DCFDA，荧光强度与活性氧的浓度呈线性关系。化学荧光探针39免疫荧光探针¾免疫荧光细胞组织化学是现代生物学中广泛应用的技术之一。¾特异性和敏性感。¾FITC类：易光漂白，对pH值的变化较敏感；¾Bodipy类：光稳定性好，发射带窄，易于多重标记，pH稳定性好。化学荧光探针40笼锁化合物探针¾笼锁化合物全称为光不稳定笼锁化合物，是人工使用掩蔽基团修饰生物活性分子而合成的无荧光前体化合物。¾当该物质被强光照射后，两基团之间的共价键解离而释放出活性分子，这个过程称为解笼锁。¾由于光化学反应的速度快，生物分子不需要经过弥散过程就可以在光解部位发挥作用；当与激光共焦扫描显微镜联用时，就可以达到极高的时空分辨率（时间上可达毫秒级，空间上可达到微米甚至更低）；加上光解过程的强度、时间和范围均可控制，生物活性物质的释放极易调节，从而为研究生理过程提供了一个强有力的工具。化学荧光探针41¾光解反应激发光的强度和波长消光系数和量子产率激发态中间产物的寿命¾光化学反应：偶氮苯的光致同分异构作用硝基甲苯的光致分解作用¾根据生物活性分子的不同来分类：笼锁神经递质、调质及配体；笼锁胞内第二信使；笼锁钙；笼锁发光基团、笼锁酶。¾应用：肌肉生理、递质释放、钙振荡、微管和微丝动力学化学荧光探针42POPO-1(P-3580),BOBO-1(B-3582),YOYO-1(Y-3601),TOTO-1(T-3600),JOJO-1(J-11372),POPO-3(P-3582),LOLO-1(L-11376),BOBO-3(B-3586),YOYO-3(Y-3606)TOTO-3(T-3604)43SYTOXBluenucleicacidstain(S-11348)44SYTOLive-CellNucleicAcidStainSamplerKit#1(S-7572)45ThechromosomeswerestainedwithDAPI(D-1306).Thecytoskeletonwasdetectedwithanti–bovine-tubulin,mousemonoclonal236-10501,biotin-XXconjugate(A-21371),whichwasthenvisualizedwithred-fluorescentAlexaFluor568streptavidin(S-11226)46DNAwasstainedwith7-aminoactinomycinD(A-1310),andmicrotubuleswerelabeledwithanti–-tubulinantibodiesinconjunctionwithfluorescein-labeledsecondaryantibody47Microtubuleswerelabeledwithmousemonoclonalanti–-tubulinantibody,biotin-XXgoatanti–mouseIgG(H+L)antibody(B-2770)andCascadeBlueNeutrAvidin(A-2663).48anti–bovine-tubulin,mousemonoclonal136-10501,biotin-XXconjugate(A-21371)andAlexaFluor568streptavidin(S-11226)49TexasRed-Xphalloidin(T-7471),whichlabelsF-actin,mousemonoclonalanti–-tubulinIgGandfluoresceingoatanti–mouseIgG(F-2761),whichlabelmicrotubules50SimultaneousvisualizationofF-andG-actininabovinepulmonaryarteryendothelialcell(BPAEC)usingF-actin–specificOregonGreen488phalloidin(O-7466)andG-actin–specificTexasReddeoxyribonucleaseI(D-972)51MitoTrackerRedCMXRos(M-7512)F-actin–specificprobeBODIPYFLphallacidin(B-607)DAPI(D-1306,D-3571)52535455565758绿色荧光蛋白基因的应用¾报告基因¾融合标记¾指示剂基因荧光探针59报告基因¾活体检测基因表达：不需要底物，¾C.elegansmec-7启动子的表达模型。¾胚胎及动物个体转基因和监测基因转移效率¾活细胞筛选：选择胚胎干细胞、得到转基因动物¾小鼠胚胎发育过程中细胞的命运。¾标记肿瘤、检测癌细胞的转移。基因荧光探针