Western-blot--帮你理解

WesternblotWesternBlot印迹法（blotting）是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。1975年，Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜（NC膜）上，并利用DNA－DNA杂交检测特定的DNA片段的方法，称为Southern印迹法。而后人们用类似的方法，对RNA和蛋白质进行印迹分析，对RNA的印迹分析称为Northern印迹法，对单向电泳后的蛋白质分子的印迹分析称为Western印迹法，对双向电泳后蛋白质分子的印迹分析称为Eastern印迹法。埃德温·迈勒·萨瑟恩（EdwinMellorSouthern）是什么？DNA重组技术siRNA的转染技术表观遗传学（甲基化，miRNA）凡是涉及蛋白水平检测的研究，均可运用到westernblot技术能做什么？为什么要作蛋白质印迹实验？研究一些体外的蛋白质分子，寻找目的蛋白是否存在样品当中蛋白质的表达情况，上调或下调表达，在不同的样品中，如疾病和正常的样品之间的表达差异性。WesternBlot基本原理在电场的作用下将电泳分离的多肽从凝胶转移至一种固相支持体，然后用这种多肽的特异抗体来检测。WesternBlotWesternBlot基本原理WesternBlot流程•一、原理•与Southern或Northern杂交方法类似，但WesternBlot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。既可以定性，又可以半定量的Western是初步鉴定蛋白质最方便也是最通用的方法。E3.SDS-PAGE电泳原理：SDS是一种离子性的界面活性剂,它有强离子性的硫酸根离子也带有疏水性的长碳链.当SDS与蛋白质混合时,它会以其碳链与蛋白质之疏水性胺基酸结合将蛋白质包起来,而以硫酸根离子外露与水分子作用.大多数蛋白质和SDS的平均结合量是1:1.4(以重量为单位),而蛋白质结合固定比例之SDS後,由於SDS带强负价,使蛋白质原先的带电价微不足道,且每单位重量之蛋白质带电价一致(chargedensity),所以决定不同蛋白的泳动速率就只剩下分子大小一项因素WesternBlot的具体步骤-滤纸凝胶膜滤纸+蛋白质印迹转移示意图电转仪极极转移方向转移液转移液三层滤纸转膜夹板NC膜主要试剂•制胶用（1-6）：•1.1.0mol/LTris•HCl（pH6.8）•Tris(MW121.14)12.114g•蒸馏水100ml•溶解后，（用浓盐酸调pH至6.8），室温下保存。•2.1.5mol/LTris•HCl（pH8.8）•Tris(MW121.14)18.671g•蒸馏水100ml•溶解后，（用浓盐酸调pH至8.8），室温下保存。•3.10％SDS•SDS10g•蒸馏水至100ml•如溶解困难，可在50℃水浴下溶解，室温保存。•如在长期保存中出现沉淀，水浴溶化后，仍可使用。•4.10％过硫酸胺（AP）•过硫酸胺0.1g•蒸馏水1ml•（现用现配，可先将过硫酸胺干粉称好分量后放在1.5mlEP管中，一次性多装几管，使用时加入蒸馏水水即可，溶解后，4℃保存，保存时间为1周）•5．四甲基乙二胺原液（TEMED）：4C保存。•6．30%丙稀酰胺：4C保存。•下层胶•依次加入去离子水5.9ml•30%丙烯酰胺5ml•1.5MTris-HCl（pH8.8）3.8ml•10%SDS150μl•10%AP150μl•TEMED6μl5%•上层胶•依次加入去离子水4.1ml•30%丙烯酰胺1ml•1MTris-HCl（pH6.8）0.75ml•10%SDS60μl•10%AP60μl•TEMED6μl•7．5X电泳液缓冲液•Tris（MW121.14）15.1g•甘氨酸（MW75.07）94g•SDS5.00g•蒸馏水至1000ml•溶解后室温保存,用时稀释5倍，通常取160ml配制成800ml即可。•8．10X转膜缓冲液•甘氨酸（MW75.07）151.1g•Tris（MW121.14）30.3g•蒸馏水至1000ml•溶解后室温保存,用时稀释10倍，并加入甲醇至20%。•通常取80ml母液，加560ml蒸馏水，最加160ml甲醇，配制成800ml即可。（先加甲醇易产生沉淀）•9．10XTBS缓冲液•Tris（MW121.14）24.2g•NaCl80.0g•蒸馏水至1000ml•（浓盐酸调pH至7.6），溶解后室温保存。•10．1XTBST缓冲液•10XTBS缓冲液100ml•蒸馏水900ml•Tween-201ml•因Tween-20比较粘稠，应缓慢吸取并可把枪头剪掉一块，即可防止产生气泡。•溶解后室温保存。•11．封闭液/抗体稀释液（5%脱脂牛奶)：•1XTBST缓冲液95-100ml•脱脂奶粉5g•溶解后4℃保存，可于一周内使用。•其他试剂•一抗、二抗、显影液、定影液、ECL化学发光试剂•A和B两种试剂WesternBlot的具体步骤3.SDS-PAGE电泳凝胶成份：丙烯酰胺N,N’-亚甲双丙烯酰胺SDS过硫酸铵TEMEDH2O仪器：电泳缓冲液：Tris-甘氨酸溶液WesternBlot的具体步骤3.SDS-PAGE电泳1.制胶需紧密固定！！WesternBlot的具体步骤3.SDS-PAGE电泳2.上样每孔上样量为20-50μg蛋白；根据目的蛋白的表达情况的不同而有所变化。WesternBlot的具体步骤3.SDS-PAGE电泳3.电泳电泳条件：推荐：浓缩胶80V35——45min分离胶120V45——75minWesternBlot的具体步骤3.SDS-PAGE电泳考马斯亮蓝染胶转膜WesternBlot实验SDS-PAGE电泳实验SDS-PAGE胶的考马斯亮蓝染色WesternBlot的具体步骤4.转膜原理：蛋白因结合SDS而带电荷，转膜即在电场作用下从胶中转至膜上的过程。WesternBlot的具体步骤4.转膜半干转湿转半干式转膜速度快，适合与小分子量蛋白湿式成功率高并特别适合用于分子量大于100KD的蛋白两种方法的转膜液不同！！方法仪器特点WesternBlot的具体步骤4.转膜表5PVDF膜、NC膜、尼龙膜特点比较WesternBlot的具体步骤4.转膜转膜准备制作“三明治”WesternBlot的具体步骤4.转膜WesternBlot的具体步骤4.转膜转膜条件：推荐：100V，1——2小时；根据蛋白大小以及胶厚度的不同而不同。WesternBlot的具体步骤5.转膜后检测：（立春红染色）为检测转膜是否成功，可用相关染料对膜进行染色。1x立春红5min染色前染色后WesternBlot的具体步骤6.封闭封闭条件：4°C摇动，封闭1hour，再用TBST洗5秒，进入下一步抗体的孵育。为防止一抗或/和二抗与膜的非特异性结合产生的高背景，因此需要进行膜的封闭，常用的封闭液：脱脂奶粉（5％）BSA（5％）WesternBlot膜封闭液（生物试剂公司提供）不能用于磷酸化蛋白！WesternBlot的具体步骤7.免疫反应1.按照抗体说明书建议的稀释倍数，用TBST稀释抗体；2.抗体孵育时间：室温下孵育1～2h或4℃过夜（一般不超过18小时）；3.保持适当的摇动使抗体与膜的结合均匀；WesternBlot的具体步骤7.免疫反应摆床上，二抗杂交，室温（25℃左右）1h，或4℃过夜。PBST(TBST)洗涤3次，每次10分钟。上二抗WesternBlot的具体步骤7.免疫反应不同二抗稀释浓度的效果图WesternBlot的具体步骤8.显色（结果检测）显色方法代表类型特点酶促底物发光法DAB显色法稳定性好，灵敏度较高（250pg），背景一般，成像性较差，药品疑有一定致癌性。化学发光法（推荐使用）ECL发光法稳定性好，灵敏度高（10-12g），背景可以很低，成像性好，且可以重复标记，暗室操作！WesternBlot的具体步骤8.显色（结果检测）A液B液11:膜混合ECL工作液WesternBlot一般流程蛋白样品的制备SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳转膜封闭一抗杂交二抗杂交底物显色WesternBlot操作步骤（一）蛋白样品制备（二）蛋白含量的测定WesternBlot（三）SDS－PAGE电泳1）清洗玻璃板：一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。两面都擦洗过后用自来水冲，再用蒸馏水冲洗干净后立在筐里晾干。WesternBlot（2）灌胶与上样1、玻璃板对齐后放入夹中卡紧。然后垂直卡在架子上准备灌胶。（操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶。）WesternBlot2、按前面方法配10％分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。灌胶时，可用10ml枪吸取5ml胶沿玻璃放出，待胶面升到绿带中间线高度时即可。然后胶上加一层水，液封后的胶凝的更快。（灌胶时开始可快一些，胶快到所需高度时要放慢速度。操作时胶一定要沿玻璃板流下，这样胶中才不会有气泡。加水液封时要很慢，否则胶会被冲变型。）WesternBlot3、当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝了。再等3min使胶充分凝固就可倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。WesternBlot4、配4％的浓缩胶,加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。灌胶时也要使胶沿玻璃板以免胶中有气泡产生。插梳子时要使梳子保持水平。由于胶凝固时体积会收缩减小，从而使加样孔的上样体积减小，所以在浓缩胶凝固的过程中要经常在两边补胶。待到浓缩胶凝固后，两手分别捏住梳子的两边竖直向上轻轻将其拔出。WesternBlot5、用水冲洗一下浓缩胶，将其放入电泳槽中。（小玻璃板面向内，大玻璃板面向外。若只跑一块胶，那槽另一边要垫一块塑料板且有字的一面面向外。）WesternBlot7、加足够的电泳液后开始准备上样。（电泳液至少要漫过内测的小玻璃板。）用微量进样器贴壁吸取样品，将样品吸出不要吸进气泡。将加样器针头插至加样孔中缓慢加入样品。（加样太快可使样品冲出加样孔，若有气泡也可能使样品溢出。加入下一个样品时，进样器需在外槽电泳缓冲液中洗涤3次，以免交叉污染。WesternBlot（3）电泳电泳时间一般4～5h，电压为40V较好，也可用60V。电泳至溴酚兰刚跑出即可终止电泳，进行转膜。WesternBlotWesternBlotWesternBlot（四）转膜（1）转一张膜需准备6张7.0～8.3cm的滤纸和1张7.3～8.6cm的硝酸纤维素膜。切滤纸和膜时一定要戴手套，因为手上的蛋白会污染膜。将切好的硝酸纤维素膜置于水上浸2h才可使用。（用镊子捏住膜的一边轻轻置于有超纯水的平皿里，要使膜浮于水上，只有下层才与水接触。这样由于毛细管作用可使整个膜浸湿。若膜沉入水里，膜与水之间形成一层空气膜，这样会阻止膜吸水。WesternBlot（2）在加有转移液的搪瓷盘里放入转膜用的夹子、两块海绵垫、一支玻棒、滤纸和浸过的膜。（3）将夹子打开使黑的一面保持水平。在上面垫一张海绵垫，用玻棒来回擀几遍以擀走里面的气泡。（一手擀另一手要压住垫子使其不能随便移动。）在垫子上垫三层滤纸（可三张纸先叠在一起在垫于垫子上），一手固定滤纸一手用玻棒擀去其中的气泡。WesternBlot（4）要先将玻璃板撬掉才可剥胶，撬的时候动作要轻，要在两个边上轻轻的反复撬。撬一会儿玻璃板便开始松动，直到撬去玻板。（撬时一定要小心，玻板很易裂。）除去小玻璃板后，将浓缩胶轻轻刮去（浓缩胶影响操作），要避免把分离胶刮破。小心剥下分离胶盖于滤纸上，用手调整使其与滤纸对齐，轻轻用玻棒擀去气泡。将膜盖于胶上，要盖满整个胶（膜盖下后不可再