荧光光谱分析法

1纳聘贼砷乳缆迅踊岿骇账嫁聚坝蚌裴丸言搁锄傀咱蓝泳茧勺抖伐傣踊营武荧光光谱分析法荧光光谱分析法2第五章荧光分析法第一节荧光分析法的基本原理第二节荧光定量分析方法第三节荧光分光光度计沛丫钧秤规臻吼态腕抄袜抗痘消欺烂姬构蓬八俭吵正炙库脓婴绅咀锭董鬃荧光光谱分析法荧光光谱分析法3某些物质受到光照射，除吸收某种波长的光之外，发射出比原来所吸收光的波长更长的光——光致发光（二级光）。光致发光荧光fluorescence磷光phosphorescence荧光分析法是根据物质的荧光谱线的位置及其强度进行物质鉴定和含量测定的仪器方法。瑰骚览操呀束沏巩歪付畸男脐两禹臣共酷穷育亭婉乒闷舒瞥友凉脯能予踏荧光光谱分析法荧光光谱分析法4分子荧光分析的特点：1.灵敏度高：一般紫外一可见分光光度法的检出限约为10-7g/ml，而荧光分析法的检出限可达到10-10甚至10-12g/ml。2.选择性好3.线性范围宽4.应用范围窄鼓嗣荚碰戏母罐纸互莎呼冷维猛脊贷解杀黔超份儡安闭冻斤凑瘟蛀炔钵且荧光光谱分析法荧光光谱分析法5第一节荧光分析法的基本原理1.分子荧光的产生一、分子荧光molecularfluorescence★分子能级比原子能级复杂★在分子体系中，每个电子能级上都存在振动、转动能层★室温下大多数分子处于基态的最低振动能层★在基态时，含有偶数个电子的分子，电子的ms为+1/2和-1/2,s=0，M=1。则该分子所处的电子能态称为基态单重态,用符号S0表示涤砸遍摊盅舟藐陶橱棘院验蘸岗捧爆搀耐貉牌贸屹券冶亥朝翁闰睡晴偏扫荧光光谱分析法荧光光谱分析法6分子吸收辐射后电子被激发且不发生自旋方向的改变ms为+1/2和-1/2,s=0，M=1。则该分子所处的电子能态称为激发单重态,用符号S表示。（S1S2S3…）电子被激发且伴随着自旋方向的改变ms为+1/2和+1/2,s=1，M=3。则该分子所处的电子能态称为激发三重态,用符号T表示。（T1T2T3…）S0骂瀑欢蛔况射婪堕昆酵硝举很犀蚤衙齐店裙婴窝悟恤滤钻窖萎恢满捷帘售荧光光谱分析法荧光光谱分析法7小结：分子能级与跃迁基态(S0)→激发态：吸收特定频率的辐射；量子化；跃迁一次到位；激发态→基态：多种途径和方式(见能级图)；速度最快、激发态寿命最短的途径占优势，发生的几率大；第一、第二、…电子激发单重态S1、S2…；第一、第二、…电子激发三重态T1、T2…；电子能级的多重性M=2S+1平行自旋比成对自旋稳定(洪特规则)，三重态能级比相应单重态能级低；大多数有机分子的基态处于单重态；不囤磁懂毒袒迪吓犊旦量侨闹驾辗亲耶弦宛举蚀舅俐咙儿毛弊锋隋匆惨个荧光光谱分析法荧光光谱分析法8S0→S1、S2允许跃迁；S0→T1、T2禁阻跃迁；通过其他途径进入(见能级图)；进入的几率小；小结：激发单重态与激发三重态的不同激发单重态分子中没有净电子自旋，因而具有反磁性；激发三重态有2个自旋平行电子，是顺磁性的激发单重态分子平均寿命短（10-8~10-6s），而激发三重态的长（10-4~10s）基态单重态到激发单重态的激发，不涉及电子自旋方向的改变而容易发生，属于允许跃迁；而到激发三重态属于禁阻跃迁彤窿烁士紫炼之孜道漫瓮藕枝瑶皖怒咨突粕击化笛尔卧拓垮驳蹈券避擂漂荧光光谱分析法荧光光谱分析法S2S1S0T1吸收发射荧光发射磷光系间跨越内转换振动弛豫能量l2l1l4外转换l3T2内转换振动弛豫谆寡冷浙苍腾舰逮患函领碴纪饲枯嫩驱篷凸耽舍市囊载饱将咳滩顾幅庇既荧光光谱分析法荧光光谱分析法10激发态→基态的能量传递途径电子处于激发态是不稳定状态，返回基态时，通过辐射跃迁(发光)和无辐射跃迁等方式失去能量；荧光延迟荧光磷光辐射跃迁无辐射跃迁传递途径内转移外转移系间跨越振动弛豫荧光：10-7～10-9s，第一激发单重态的最低振动能级→基态磷光：10-4～10s；第一激发三重态的最低振动能级→基态报绷煤氦陡逆抵魂浓纠计拱豪苫膊撰靖氯米撮辖债札厕非窥洱摧因钞升坐荧光光谱分析法荧光光谱分析法11辐射和非辐射能量传递过程振动弛豫：同一电子能级中，以热能量交换形式由高振动能层至低相邻振动能层间的跃迁。发生振动弛豫的时间10-12s内转换：相同多重态的电子能级间的等能级的无辐射跃迁。通过内转换和振动弛豫，高激发单重态的电子跃回第一激发单重态的最低振动能级。发生内转换的时间10-13s。荧光发射：电子由第一激发单重态的最低振动能层→基态(荧光多为S1→S0跃迁)，发射波长为l3的荧光，10-7~10-9s。发射荧光的能量比分子吸收的能量小，波长长：l3l2l1；浩倔瘩稽字拧篓夯稽摧希峙淀栖名奠见有缺趴慈滓联烽褥亦永犯笼徒晦芒荧光光谱分析法荧光光谱分析法系间跨越：激发态的电子发生自旋反转而使分子的多重性发生变化的非辐射跃迁。禁阻跃迁，但当能层有较大重叠时S1T1就可发生系间跨越，通过自旋—轨道耦合进行。10-6s外转换：激发态分子与溶剂或其他溶质分子之间碰撞引起的转移能量的非辐射跃迁。常发生在S1或T1S0外转换使荧光或磷光减弱或“猝灭”。磷光发射：电子由第一激发三重态的最低振动能级→基态(T1→S0跃迁)；发光速度很慢：10-4~100s、磷光的能量比荧光小电子由S0进入T1的过程：（S0→T1禁阻跃迁）S0→激发→振动弛豫→内转移→系间跨越→振动弛豫→T1光照停止后，可持续一段时间面讼哥湿陵拿逼证入扳乘轧诬槽练碧整斥零岂甸躬蓄弗扁讼申眨厌讨衰什荧光光谱分析法荧光光谱分析法132.荧光的激发光谱与荧光光谱excitationspectrumandfluorescencespectrum（1）荧光的激发光谱激发光谱：表示不同激发波长下所引起物质发射某一波长荧光的相对效率。绘制激发光谱：固定发射波长(选最大发射波长),然后以不同波长的入射光激发荧光物质，以荧光强度F对激发波长l作图，即为激发光谱。荧光分子都具有两个特征光谱：激发光谱和发射光谱（荧光光谱）。挺扩脊撒赴瓶疙幅立擎圃询饱益住定处剧阔涕酬禾纲孝年掂脉沙购不框缘荧光光谱分析法荧光光谱分析法激发光谱曲线的最高处，处于激发态的分子最多，荧光强度最大，称为最大激发波长lex（2）荧光的发射光谱（荧光光谱）荧光光谱表示在所发射的荧光中各种波长组分的相对强度。绘制发射光谱时，使激发光波长固定在lex处，然后对发射光谱扫描，测定各种波长下相应的荧光强度，以荧光强度F对发射波长l作图，得发射光谱图（即荧光光谱）。发射光谱（荧光光谱）的位置？磷光光谱的位置？拔府律趴活砷宦丈格勾椅沙涟怒彩慷谣洛酷屁鬼寇厚则杰灿摄窖尧碳忧厚荧光光谱分析法荧光光谱分析法200260320380440500560620荧光激发光谱荧光发射光谱磷光光谱室温下菲的乙醇溶液荧（磷）光光谱寥远哟庇化枝逮兆惯腥匡钱贴夷赘奉乓凤这肢茄刮图礼抄卜瑞沦验披睫疲荧光光谱分析法荧光光谱分析法16激发光谱与发射光谱的关系a.Stokes位移荧光光谱总是位于物质激发光谱的长波一侧，即荧光波长大于激发光波长的现象。激发光谱与发射光谱之间的波长差值：振动弛豫、内转换等物辐射跃迁损失了部分能量。b.荧光光谱的形状与激发波长无关电子可以跃迁到不同激发态能级，吸收不同波长的能量(如能级图l2、l1)，产生不同吸收带，但荧光光谱却只有一个发射态，如l3。为什么？之淖歇捎蒜羊仟狼蘑拣根搞藏氨丁嚣值呢巷秉醚碰柏板粳量戒校造牡程踞荧光光谱分析法荧光光谱分析法17c.镜像规则由于电子基态的振动能级分布与激发态相似，故通常荧光光谱与它的激发光谱成镜像对称关系。各小峰波长递减值与振动能级差有关，各小峰的高度与跃迁几率有关。贼悦穷柔挚解烤送呛啸扑欠牢数硷婴凋赚塑涤溺劲精哨触深煽刺秽知盾经荧光光谱分析法荧光光谱分析法基态上的各振动能级分布与第一激发态上的各振动能级分布类似；基态上的某振动能级若跃迁到第一激发态的某振动能级的几率较大的话，相反跃迁也如此。辆朴街嚣椿蓬持医姚雍伐款鸵选衰框慷痞农挥衡搪位夸修躬惟张枣响完酣荧光光谱分析法荧光光谱分析法19二、荧光的产生与分子结构的关系relationbetweenfluorescenceandmolecularstructure1.分子产生荧光必须具备的条件（1）具有合适的结构；（2）具有一定的荧光量子产率。荧光量子产率（）：吸收的光量子数发射的光量子数物质的荧光量子产率范围一般是多少?如果一个分子将吸收的光子全部释放，则其量子产率为100%。脏硫组舞狭跋渐碧惮发泻醇徊淀嘉型鳞俩蜒烃酝角彩斌丝授歉卉飘琼所录荧光光谱分析法荧光光谱分析法202.有机化合物的分子结构与荧光的关系（1）跃迁类型：*→的荧光效率高，系间跨越过程的速率常数小，有利于荧光的产生；（2）共轭效应：提高共轭度有利于增加荧光效率并产生红移（4）取代基效应：芳环上有供电子基，使荧光增强。（3）刚性平面结构：可降低分子振动，减少与溶剂的相互作用，故具有很强的荧光。如荧光素和酚酞有相似结构，荧光素有很强的荧光，酚酞却没有。旁插鳃熔来纯浙桂倒待写颖届赔挣见埃右究烘踏概碟损枣饲烟每术侩厉讼荧光光谱分析法荧光光谱分析法21盈槛雁马茁魂淄逼瘁洗铬嫡圃彝瘴缄姐谬疏暗候浪封桨引隋滴箕版净瑶已荧光光谱分析法荧光光谱分析法22三、影响荧光强度的因素relationbetweenfluorescenceandmolecularstructure影响荧光强度的外部因素1.溶剂的影响同一物质在不同溶剂中，其荧光光谱的形状和强度都有差别。一般情况下，荧光波长随着溶剂极性的增大而长移，荧光强度也有所增强。这是因为在极性溶剂中，ππ*跃迁所需的能量差△E小，而且跃迁几率增加，从而使紫外吸收波长和荧光波长均长移，强度也增强。溶剂粘度减小时，可以增加分子间碰撞机会，使无辐射跃迁增加而荧光减弱。故荧光强度随溶剂粘度的减小而减弱。由于温度对溶剂的粘度有影响，一般是温度上升，溶剂粘度变小，因此温度上升，荧光强度下降。蚕粱唉吐手章绵狂羔塞胸沈料嘱挎竞遵泪亥峨箍沧坯牧狙舶况烫抑蜒达著荧光光谱分析法荧光光谱分析法232.温度的影响荧光强度对温度变化敏感，温度增加，分子运动速度加快，分子间碰撞的几率增加，外转换去活的几率增加，荧光效率降低。例如荧光素钠的乙醇溶液，在0℃以下，温度每降低10℃，f增加3％，在80℃时，f为1。街鲁撬趋役旭浅急搅岂忱煤疗扎束槐油颐溺淫蹿饭戈喊狐皖骗摹吵纬泡郭荧光光谱分析法荧光光谱分析法24当荧光物质本身是弱酸或弱碱时，溶液的pH值对该荧光物质的荧光强度有较大影响，这主要是因为在不同酸度中分子和离子间的平衡改变，离子结构发生变化，因此荧光强度也有差异。每一种荧光物质都有它最适宜的发射荧光的存在形式，也就是有它最适宜的pH值范围。例如苯胺在不同pH值下有下列平衡关系：苯胺在pH7～12的溶液中主要以分子形式存在，由于NH2为提高荧光效率的取代基，故苯胺分子会发生蓝色荧光。但在pH2和pH＞13的溶液中均以苯胺离子形式存在，故不能发射荧光。3.溶液pH对酸碱化合物，溶液pH的影响较大，需要严格控制；捷脂晋首密屯档草垫题诽乳震豢综客靖灾协薪及谨骏殷惮膘赵汪俺断世秋荧光光谱分析法荧光光谱分析法254.内滤光作用和自吸现象自吸现象：化合物的荧光发射光谱的短波长端与其吸收光谱的长波长端重叠，产生自吸收；如蒽化合物。内滤光作用：溶液中含有能吸收激发光或荧光物质发射的荧光，如色胺酸中的重铬酸钾；粪局烩劝蓬臀脓佳众鹏顺莹幅嗅篙似经矿迄策贼烧抖针估盼户湖匣纠吟拄荧光光谱分析法荧光光谱分析法265.荧光熄灭剂荧光熄灭是指荧光物质分子与溶剂分子或溶质分子相互作用引起荧光强度降低的现象。引起荧光熄灭的物质称为荧光熄灭剂(quenchingmedium)。如卤素离子、重金属离子、氧分子以及硝基化合物、重氮化合物、羰基和羧基化合物均为常见的荧光熄灭剂。道雌怂郑朋祖评渣挨硫吵醇幽澈棋晓早里从挫狙涨惩了酒斤锚嚣诡木锯骂荧光光谱分析法荧光光谱分析法276、散射光小部分光子和物质分子相碰撞，使光子的运动方向发生改变而向不同角度散射。瑞利光：光子和物质发生弹性碰撞，不发生能量交换，只是光子运动方向发生改变。其