蛋白切胶纯化方法

切胶纯化蛋白制备方法----杨贝贝一、切胶纯化1取500μL包涵体提取液处理后不插样品梳直接上样，按常规方法进行SDS-PAGE；电泳毕，将切下的胶放入一干净大平皿中，用适量的0.25mol/L的KCl溶液染色5min；2用手术刀片小心切下染成银白色的目的带并移入另一平皿中；3用PBS洗3次或用蒸馏水连续冲洗3min后，将胶条移入一干净的小袋中、碾碎（不好碾碎）；4为进一步促进蛋白释放，可-20℃反复冻溶3次以上（冻融次数多，蛋白回收效率高），3000g,10min离心，取上清,再用0.45um滤膜过滤，测定蛋白浓度，用于免疫小鼠或ELISA包被抗原。冻融方法：装入密封袋，碾成小的碎块后，冻于-20℃。约2h后（胶冻上即可）取出，碾碎；继续放-20℃；反复数次。1过滤：加适量PBS，吹打混匀，吸入注射器中，在吹打几次，0.22umfilter过滤（可以多加几次PBS过滤2-3遍，以最大量回收目的蛋白）或者：若胶碾得过碎，不应使用注射器过滤（会堵住滤膜），可以加PBS反复吹打，转入50/15mlEP管，3500g,4℃离心吸取上清。浓缩：超滤管浓缩，直到浓缩到合适的浓度（1000ng/ul）。纯化完毕，做WB进一步检测纯度。二、抗原的乳化试剂和用具：CFA/IFA抗原三通头、三通管1ml注射器针头塑封膜初次免疫用弗氏完全佐剂，100ug/只，与抗原1:1混合；抗原解冻后重新测蛋白浓度，算出所需总体积（相应多算一点，因乳化过程会有损失），一个三通多算300-500ul.三通管里一管加佐剂，一管加抗原，连续吹打0.5—1h，根据经验判断是否乳化完全（也可将乳化液体滴加到清水中，5~10min内没有出现明显的扩散现象）；我的判断标准：当推动三通管由难变易时，即表示乳化完全。抗原乳化后，忌见空气，一定密封好，不要让其氧化了。乳化好的抗原用塑封膜密封好，放4℃，可保存数日；用时直接套上1ml注射针头接种小鼠。三、免疫小鼠1、试剂/用具：乳化好的抗原打孔器1ml注射器（多带）酒精棉球卫生纸marker笔标签纸（白服）手套口罩2、方法：首免：皮下多点注射抗原：切胶纯化的his-Il-21注意固定小鼠的姿势，以及是否能挑起皮肤二免：皮下多点注射(抗原：切胶纯化的his-Il-21注：二免前，断尾采血（剪0.1mm），取对照组阴性血清，以及免疫组血清，测血清效价。ELISA检血清效价方法：包被抗原：1ug/ml—4ug/ml(具体浓度需要做方阵滴定法进行摸索)血清：2倍梯度稀释，从1:100—1:102400都做。且为了避免筛出针对标签的假阳性的抗体，筛选时尽量用与免疫时不同标签的同种抗原去筛，如免疫用的His标签蛋白,筛选时可以用Fc标签的蛋白。最终想要获得针对天然蛋白构象表位的抗体，建议表达一批有活性的蛋白用作最终的筛选。三免、加强免：腹腔注射；不加佐剂。