2015分子遗传检测实验室的规范化-李金明

分子遗传检测实验室的规范化李金明国家卫生计生委临床检验中心常见疾病及检测项目单基因遗传病：如Duchenne肌营养不良（DMD/BMD）（X性连锁隐性遗传病，DMD基因部分缺失或重复，以及非缺失型）、α和β地中海贫血（常染色体隐性遗传病，α珠蛋白基因缺失或突变，β珠蛋白基因突变）等线粒体遗传病：Leber遗传性视神经病、线粒体脑肌病、药物性耳聋、线粒体糖尿病等染色体非整倍体无创产前筛查（唐氏、13和18三体）常用的检测方法PCR-Sanger测序多重连接探针扩增技术（MPLA）实时荧光PCRPCR-焦磷酸测序PCR-基因芯片杂交PCR-时间飞行质谱生物芯片系统新一代高通测序技术荧光原位杂交（FISH）临床分子诊断技术发展历程：几个里程碑1953年:DNA双股螺旋的发现1963年:放射免疫测定技术1972~1977年:重组DNA技术、核酸测序方法1983年:PCR测定技术1991-1993年:实时荧光PCR技术和芯片技术2003年：人类基因组计划基本完成。后基因组的功能基因组研究，药物基因组学2007年--新一代高通量测序技术？分子遗传检测实验室规范化的5W1H（Why、What、When、Where、Who、How）诊断医学70%以上信息来自实验室诊断监测预后预测个体化医疗（personalizedmedicine)精准医疗（precisionmedicine）移动医疗数字医疗Why诊断医学的时代？没有精准检测何来精准医疗？精准医学计划（PrecisionMedicineInitiative）新生儿测序计划（BabySeqProject）PCR-Sanger测序、PCR-电泳、PCR-杂交（膜上、芯片、乳胶颗粒等）、NIPT等均涉及基因扩增过程，属于临床基因扩增检验实验室NIPT的优越性：对T21、T18和T13阳性预测值（PPV）从标准筛查方法的3.4%、14.0%和3.4%提高到80.9%、90.0%和50%。NortonMEetal.NEJM2015,372(17)国内回顾1990年：PCR技术在国内开始用于临床检测1990年代中期：假阳性？（假阴性？）国内回顾1999年4月29-30日：《基因扩增技术临床应用专家研讨会》，针对临床开展PCR检验的问题，达成8点意见：（1）PCR技术本身没有问题，技术先进。（2）卫生部暂停临床应用有助于规范管理，应在严格管理的基础上适度开放。（3）限定临床开展PCR检验项目上。（4）加强对PCR实验室管理。（5）人员上岗培训。（6）应有室内质控和参加部中心室间质评。（7）SFDA尽管批准试剂文号。（8）成立专家咨询委员会。1999年8月17-24日：《第一期全国临床基因扩增实验室技术人员培训班》在北京卫生部临床检验中心举办2002年1月14日卫生部下发《临床基因扩增检验实验室管理暂行办法》（卫医发[2002]10号）国内回顾《医疗机构临床基因扩增检验实验室管理办法》（卫办医政发〔2010〕194号）《医疗机构临床基因扩增检验实验室工作导则》（卫办医政发〔2010〕194号）What（必要条件）标本是正确的和好的：采集、运送和保存实验室环境条件是好的：温湿度、可能的干扰的避免（分区、灰尘、电磁、振动等）仪器设备状态是好的：维护、定期校准试剂是好的：性能验证、质检实验室人员是有能力的：外部和内部培训，能力评估得到结果的过程是有监控的：室内质量控制和室间质量评价（或实验室间比对）临床医生能正确的理解和应用检验结果于患者疾病的诊断和治疗质量保证标本采集、运送和保存（分析前）室内质控（分析中）室间质评（分析中）结果报告解释及临床应用（分析后）分析前检验申请单和标本采集、运送和保存中的关键点对“Who”在“When”开出“What”申请单容器：密闭的、一次性、无菌、无核酸酶及其他扩增抑制物采集方法：人（训练有素）、防污染、处理运送保存时间和温度：尽可能快？低温？合格标本:容器完整、量够、时间符合要求、外观符合要求、处理符合要求用于NIPT的外周血cffDNA特点母体血浆中cffDNA含量占总游离DNA的大约5〜10％，长约150bp，怀孕4周即能检出，其在血液中的半衰期只有16min，出现2小时后即不能测出。cffDNA在母体循环中较稳定，可能与来源于胎盘的微粒能够保护他们免受核酸酶降解相关。CffDNA随着妊娠孕龄增加而增多，在前三个月每周增加21％，在孕中期上升速度较慢，在孕期的后八个星期又急剧上升。cffDNA在-20℃下可稳定超过4年，但血浆样本在-20℃下长时间保存，cffDNA每月以-0.66GE/ml速率降解。Who:正常孕妇(产筛高风险≥35岁？孕周12周？双胎？恶性肿瘤？夫妇染色体异常？…)When：12周(-26+6周？)What:NIPT血浆样本可在-18℃~-25℃短暂储存1周，在-70℃以下储存2年，反复冻融次数应不超过2次。分析中实验室物理分区及空气流向控制产前筛查与产前诊断（全基因组低拷贝测序技术）缓冲间测序区空气流向空气流向空气流向空气流向缓冲间缓冲间缓冲间专用走廊工作流向文库扩增与检测区标本与文库制备区试剂准备区标本与文库制备区文库扩增与检测区测序区植入前胚胎遗传学诊断(全基因组低拷贝测序)缓冲间测序区空气流向空气流向空气流向空气流向缓冲间缓冲间缓冲间专用走廊文库检测区WGA制备区试剂准备区缓冲间缓冲间空气流向空气流向电泳区扩增一区遗传病诊断+肿瘤诊断与治疗（杂交捕获测序技术+Sanger测序验证）DNA打断区缓冲间缓冲间杂交捕获区（扩增一区）空气流向空气流向空气流向空气流向缓冲间缓冲间缓冲间专用走廊文库扩增区（扩增二区）标本与文库制备区试剂准备区文库检测区测序区电泳区空气流向空气流向空气流向空气流向缓冲间缓冲间缓冲间缓冲间杂交捕获区（扩增一区）空气流向空气流向空气流向空气流向缓冲间缓冲间缓冲间专用走廊文库扩增区（扩增二区）标本与文库制备区试剂准备区文库检测区测序区电泳区空气流向空气流向空气流向空气流向缓冲间缓冲间缓冲间关于“分区”、缓冲间和生物安全柜“各区独立注意风向因地制宜方便工作”实验室应根据自己的检验项目、所采用的检测技术平台和工作量来决定分区的多少及各区域的空间大小。至少具体需要多少个区，同样是“个体化”的，以“工作有序、互不干扰、防止污染、报告及时“作为基本原则。缓冲间的功能是“控制空气的流向”。生物安全柜可考虑“A2”。缓冲间测序区空气流向空气流向空气流向空气流向缓冲间缓冲间缓冲间专用走廊工作流向文库扩增与检测区标本与文库制备区试剂准备区通风换气？试剂方法的可靠性性能验证（verification）？性能确认（validation）?LDTs？性能指标？精密度（重复性）准确性（正确度，方法学比较）可报告范围（线性范围）参考区间分析敏感性（测定下限）分析特异性抗干扰能力临床特异性和临床敏感性？“性能验证”（“verification”）定义“verification”：broadlyas“confirmationthroughtheprovisionofobjectiveevidence,thatspecifiedrequirementshavebeenfulfilled”.（广义为通过提供客观证据证明特定的要求得到满足）CLIAusestheterm“verification”：specificallytorelatetoconfirmationthatthelaboratoryusingatestcanreplicatethemanufacturer’sperformanceclaimswhenthetestisusedaccordingtothepackageinsert.（CLIA性能验证术语特指使用某特定检测试剂或系统的实验室按照所提供的试剂盒或检测系统说明书使用时，能复现生产厂家所宣称的检测性能。）如果不按商品试剂盒说明书操作或改变商品试剂盒组份是否可以？可以但属于实验室自配试剂或自建方法，亦即Laboratory-developedtests,LDTs)“性能确认”（“validation”）定义TheFDAandISObothdefinetheterm“validation”as“confirmationbyexaminationandprovisionofobjectiveevidencethattheparticularrequirementsforaspecificintendedusecanbeconsistentlyfulfilled”.（通过检查和提供客观证据证明，对一特定预期用途的要求始终能得到满足）TheFDAandISOtermsforverificationandaresimilar,withthedistinctionhavingtodowithintendeduse.（性能验证和性能确认FDA和ISO术语相似，差异在后者的“预期用途”）“intendeduse”预期用途Theterm“intendeduse”inthesedocumentsisestablishedbythemanufacturerordevelopinglaboratoryatthetimeofassaydevelopmentandhastodowiththepurposeandpopulationforwhichthetestwasintended(e.g.,diagnosis,followingtreatment,etc.).Relevantperformancecharacteristicsarethendeterminedbasedontheintendeduseofthetest.Somepeopleinterpret“intendeduse”asreferringtotherelevantclinicallaboratoryinwhichthetestisperformed,ratherthanthemanufacturerordevelopinglaboratory,thuscausingconfusion.TheWorldHealthOrganization(WHO)definesvalidationas“theaction(orprocess)ofprovingthataprocedure,process,systemequipmentormethodusedworksasexpectedandachievestheintendedresult”.（WHO将validation定义为，证明所使用的一个程序、过程、系统设备或方法能按预期进行工作以及取得预期结果的活动（或过程）“validation”通俗一点的定义theterm“validation”willbeusedtorefertotheanalyticperformancecharacteristicsthatneedtobeinitiallyestablishedatthetimeofassaydevelopment.（指在测定方法研发时，最早建立的分析性能特征）结果报告的内容和格式遗传检测报告至少要包括的信息将报告与特定患者联系在一起的惟一编号咨询人员的姓名和联系方式与检测结果解释有关的特异的信息和检测性能检验项目及所使用的方法（包括检测范围及检测局限性）标本类型标本接收日期检测实验室名称，地点，包括咨询实验室检验结果根据检测特性和其它提供给实验室的信息对结果的解释报告批准人的签字实验室联系方式报告日期适当时，还应包括：建议的有资质的遗传咨询人员；对其他家庭成员的意义；进一步的检测建议MM20-A.(vol.32.No.15)Qualitymanagementformoleculargenetictesting,Approvedguideline供参考的标准报告格式XXXXXX医院临床分子检测报告报告