细胞培养基本技术1

细胞培养基本技术细胞培养的甚本概念•传代：•细胞在培养器皿中生长一定时间后，被分开接种到新的培养器皿中。•原代培养•取自体内新鲜组织并置于体外条件下生长的细胞在传代之前称为原代培养。••细胞培养：使用单个细胞悬液•组织培养：使用组织块（O.5～1立方毫米）或薄片（厚0.2毫米）•器官培养：使用器官原基或器官的一部分或整个器宫原代培养细胞的生命归宿•原代培养期•传代期•衰退期培养细胞的特性•培养细胞的生长方式•贴附生长：•必须贴附于支持物表面才能生长。见于各种实体瘤细胞•悬浮生长：•于悬浮状态下即可生长，不需要贴附于支持物表面。见于各种造血系统肿瘤细胞每代贴附生长细胞的生长过程•游离期•贴壁期•潜伏期•对数生长期•停止期（平台期）•游离期：•细胞接种后在培养液中呈悬浮状态．也称悬浮期。此时细胞质回缩，胞体呈圆球形。•10分钟一4小时•贴壁期：•细胞附着于底物上，游离期结束。细胞株平均在10分钟一4小时贴壁。•底物：胶原、玻璃、塑料、其它细胞等•血清中有促使细胞贴壁的冷析球蛋白和纤粘素、胶原等糖蛋白（生长基质），这些带正电荷的糖蛋白的促贴壁因子先吸附于底物上，悬浮细胞再与吸附有促贴壁因子的附着。•进口塑料培养瓶涂有生长基质（化学合成的功能基团）•潜伏期•此时细胞有生长话动，而无细胞分裂。细胞株潜伏期一•般为6～24小时。•对数生长期：•细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳，最适合进行实验研究。•停止期（平台期）：•细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再分裂•机制：接触抑制、密度依赖性培养细胞生长的条件•1细胞的营养需要•2细胞的生存环境•温度:37℃•O2•CO2:5%CO2+H2O←→H2CO3←→H++HCO3-•pH:7.2-7.4•渗透压•3无污染•4无毒实验准备实验用品：•超净工作台，压力蒸汽消毒器，电热干燥箱，滤器，酸缸•CO2培养箱•倒置显微镜•酶标仪、微孔板震荡器•液氮罐•自动双重纯水蒸馏器，纯水仪•耗材：培养瓶，吸管，电动吸引器，培养板，冻存管•压力蒸汽消毒器：湿热消毒，用途广•电热干燥箱：干热消毒（160℃，2小时）。主要用干玻璃•器皿消毒•滤器：过滤除菌：大多数培养用液，如人工合成培养基、血清、•酶液等均采用滤过法除菌•超净工作台：为细胞操作提供无菌环境•紫外灯：紫外线消毒。主要用于培养室空气、操作台、塑料•培养皿和培养板等表面消毒••常用玻璃器皿清洗•浸泡（自来水）、刷洗（洗衣粉）、酸泡（24小时）、•流水冲洗、蒸溜水浸泡和冲洗、50℃烘干清洁液的配制2细胞培养用液的配制水：新鲜配置的三蒸水或去离子水平衡盐溶液：无Ca2+、Mg2+的缓冲液PBS：NaCl8.0gKCl0.2gNa2HPO4.H2O1.56gKH2PO40.20加水至1000ml•消化液：•胰蛋白酶作用于与赖氨酸或精氨酸相连接的肽健，除去细胞间粘蛋白及糖蛋白，影响细胞骨架，从而使细胞分离。••胰蛋白酶液浓度越高，作用越强，但超过一定限度会损伤细胞。•胰蛋白酶是一种黄白色粉末，用无Ca2+、Mg2+的PBS缓冲液配制常用的胰蛋白酶液浓度是0.25％。用滤器过滤除菌。•胰蛋白酶液消化时间：2-10分钟。•用含血清培养液终止其对细胞的消化作用培养基•培养基（培养液）是维持体外细胞生存和生长的溶液，分天然培养基和合成培养基。•天然培养基：•天然培养基有血清、血浆、和组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液）。•优点：营养成分丰富，培养效果好•缺点：来源受限。•成分复杂，影响对某些实验产物的提取和实验结果的分析。•易发生支原体污染合成培养基•合成培养基是根据细胞生存所需物质的种类和数量，用人工方法模拟合成的。目前已设计出许多种培养基，如TC199、MEM、RPMI-1640、DMEM等。•合成培养基主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐和其它一些辅助物质。•优点：标准化生产，组分和含量相对固定。•成本低•缺点：缺少某些成分，不能完全满足体外细胞生长需要。•人工合成培养基只能维持细胞生存，要想使细胞生长和繁殖，还需补充一定量的天然培养基（如血清）。•血清中含有：•①多种蛋白质（白蛋白、球蛋白、铁蛋白等）•②多种金属离子；③激素；④促贴附物质，如纤粘蛋白、冷析球蛋白、胶原等。•⑤各种生长因子•⑥转移蛋白•⑦不明成分•一般说来．含5％小牛血清的培养基对大多数细胞可以维持细胞不死．但支持细胞生长一般需加10％血清．•对于血清支持细因生长的生物学效应已得到证明，但对血清中的复杂成分至今尚未完全清楚．•血清中不仅存在促细胞生长因子，同对也存在细胞生长抑制因子或毒性因子，因此在含血清培养基中培养的细胞所反映的生物学特性是细胞和复杂血清因子的综合反应。•在生长因子、蛋白质工程、基因表达调控等研究领域，迫切需要用无血清培养基培养细胞．•无血清培养基的主要研制策略：在基础培养基中补充各种必需因子，如激素、生长因子、结合蛋白、贴壁和扩展因子等。•无血清培养基由基础培养基和替代血清的补充成分组成。•1975年，Sato首次成功地用无血清培养基培养了垂体细胞株，近20多年来已报道了几十种细胞系在无血清培养基中成功地生长和增殖。•无血清细胞培养基的使用保证了实验结果的准确性、可重复性和稳定性，，减少了细胞污染，简化了提纯和鉴定各种细胞产物的程序。•向无清培养液中能促进细胞系生长的补加物都是独特的。适用于某种细胞株的培养液，很可能不适合另一种细胞株的生长。即使同源组织的不同细胞株，所需补加物也不同。无血清培养基尚处于研究阶段，难以推广。目前，绝大多数人工合成培养基使用时还需添加血清•血清质量好坏是实验成败的关键。•常用血清有胎牛血洁、新生牛血清、小牛血情、兔血清、马血清等，其中以胎牛血清质量最好。•优质血清的标准：透明，淡黄色，无沉淀物，无细菌、支原体、病毒污染。•血清的灭活（消除补体活性）：56℃，30分钟•血清的消毒：过滤除菌•抗菌素的使用：•在培养液配制后，培养液内常加适量抗菌素，以抑制可能存在的细菌的生长。•通常是青霉素和链霉素联合使用。培养基内青霉素、链霉素最终使用浓度为每毫升100单位。•庆大霉素：每毫升100单位——方便、广谱、稳定完全培养基的组成•基础培养基80％一95％•血清5％一20％•碳酸氢钠2.0g/L•青、链霉素各100卑位／毫升培养基的配制RPMI-1640培养粉1袋碳酸氢钠2.0g青、链霉素各100单位／毫升加三蒸水至1000ml,过滤除菌。调节pH值至7.2加血清（终浓度10％）细胞传代方法•根据细胞生长的恃点，传代方法有3种。•1悬浮生长细胞传代•离心法传代：离心（1000转/分）去上清，沉淀物加新培养液后再混匀传代。•直接传代法：悬浮细胞沉淀在瓶壁时，将上清培养液去除l／2一2／3，然后用吸管直接吹打形成细胞悬液再传代。•2半悬浮生长细胞传代（Hela细胞）•此类细胞部分呈现贴壁生长现象，但贴壁不牢，可用直接吹•打法使纫胞从瓶壁脱落下来，进行传代。•3贴壁生长细胞传代•采用酶消化法传代。常用的消化液有0.25％的胰蛋白酶液。细胞的传代•体外培养的原代细胞或细胞株要在体外持续地培养就必须传代，以便获得稳定的细胞株或得到大量的同种细胞，并维持细胞种的延续。培养的细胞形成单层汇合以后，由于密度过大生存空间不足而引起营养枯竭，将培养的细胞分散，从容器中取出，以1:2或l:3以上的比率转移到另外的容器中进行培养，即为传代培养。贴壁生长细胞传代方法：•1吸光培养瓶中的培养液•2加入1-2ml0.25％的胰蛋白酶液(以消化液能覆盖整个瓶底为准）•静置2-10min（显微镜下动态监测）,在倒置镜下观察被消化的细胞，如果细胞变园，相互之间不再连接成片，这时应立即在超净台中将消化液倒掉，加入3～5ml新鲜培养液，吹打，制成细胞悬液。•3吸取2ml细胞悬液，接种于新的培养瓶内。•4并向每个瓶中分别加3ml左右培养液，盖好瓶盖，放入培养箱中培养。无菌操作注意事项•无菌操作中的注意事项•在无菌操作中，一定要保持工作区的无菌清洁。为此，在操作前要认真地洗手并用75％乙醇消毒。操作前20～30分钟起动超净台吹风。操作时，严禁说话，严禁用手直接拿无菌的物品，如瓶塞等，而要用器械，如止血钳、镊子等去拿。培养瓶要在超净台内才能打开瓶塞，打开之前用乙醇将瓶口消毒，打开后和加塞前瓶口都要在酒精灯上烧一下，打开瓶口后的操作全部都要在超净台内完成。操作完毕后，加上瓶塞，才能拿到超净台外。使用的吸管在从消毒的铁筒中取出后要手拿末端，将尖端在火上烧一下，戴上胶皮乳头，然后再去吸取液体。总之，在整个无菌操作过程中都应该在酒精灯的周围进行。细胞计数•血细胞计数器：手工计数细胞•Coulter计数仪：人工计数培养细胞活力测定•细胞活力测定是肿瘤体外研究中应用最广的技术手段之一。•任何培养瓶内生长的细胞都由死细胞和活细胞组成，从形态上区别死、活细胞是困难的。•1细胞克隆形成率实验单个细胞在体外增殖6代以上，其后代所组成的细胞群体形成肉眼可见的克隆。克隆形成卒用来表示细胞的增殖能力•克隆形成率比＝克隆形成数／接种细胞数•缺点：操作繁琐•优点：精确、可靠2台盼蓝法•活细胞不被染色，死细胞染成蓝色，用活细胞占•细胞中的百分比表示细胞恬力••已淘汰3四唑盐（MTT）比色法•四唑盐（MTT）商品名为噻唑蓝，•四吐盐比色法的原理：活细胞中脱氢酶能将四唑盐还原成不溶干水的蓝紫色产物（formazan)，并沉淀在细胞中，而死细胞没有这种功能。二甲亚砜（DMSO）能溶解沉积在细胞中蓝紫色结晶物，溶液颜色深浅与所含的formazan量成正比。再用酶标仪测定OD值•MTT法简单快速、准确，广泛应用于新药筛选、细胞毒牲试•验、肿瘤放射敏感性实验等。•操作步骤•（1）单细胞悬液接种于96孔培养板；103-104细胞/孔，每孔培养基总量200微升（96孔培养板每孔容积370微升），37℃、5％•CO2培养箱中培养一段时间（根据实验目的决定培养时间）•（2）加入2毫克／毫升的MTT液（50微升／孔）；继续培养3小时。•（3）吸出孔内培养液后，加入DMSO液（150微升／孔），将培养板置于微孔板扳荡器上振荡10分钟，使结晶物溶解。•（4）酶标仪检测各孔OD值（检测波长570纳米）。记录结果，绘制细胞冻存和复苏•细胞低温冷冻贮存是细胞室的常规工作。细胞冻存与细胞传代保存相比可以减少入力、经费，减少污染，减少细胞生物学特性变化。冻存和复苏的原则：慢冻快融•当细胞冷到零度以下，可以产生以下变化：细胞器脱水，细胞中可溶性物质浓度升高，并在细胞内形成冰晶。••如果缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内不致产生大的冰晶；相反．结晶就大，大结晶会造成细胞膜、纲胞器的损伤和破裂。复苏过程应快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重结晶。慢冻程序•标准程序：•当温度在-25℃以上时，1～2℃/min•当温度达-25℃以下时，5～10℃/min•当温度达-100℃时，可迅速放入液氮中•细胞冻存器•简易程序：•将冷冻管（管口要朝上）放入纱布袋内，纱布袋系以线绳，通过线绳将纱布袋固定于液氮罐罐口，按每分钟温度下降1～2℃的速度，在40分钟内降至液氮表面，停30分钟后，直接投人液氮中。低温保护剂的应用•在细胞冻存时加入温保护剂，能大大提高冻存效果。•常用的低温保护剂是DMSO，它是一种渗透性保护剂，可迅速透入细胞，提高胞膜对水的通透性，降低冰点，延缓冻结过程，能使细胞内水分在冻结前透出细胞外，在胞外形成冰晶，减少胞内冰晶，从而减少冰晶对细胞的损伤。细胞冻存方法•1预先配制冻存液：含20%血清培养基•10%DMSO•2取对数生长期细胞，经胰酶消化后，加入适量冻存液,用吸管吹打制成细胞悬液（1×106～5×106细胞/ml)•3加入1ml细胞于冻存管中，密封后标记冷冻细胞名称和冷冻日期。•4年后，存洁率可达80％一叽％。DMSO液用培养液配好，•避免因临时配制产热而伤害细胞。对人造血干细胞的研究证细胞复苏方法•（l）从液氮中取出冷冻管，迅速投入37～38℃水浴中，使其融化（1分钟左右）。•（2）5分钟内用培养液稀释至原体积的10倍以上。•（3）低速离心10