细胞的传代培养

细胞的传代培养细胞传代培养概念：培养的细胞由于细胞增殖，数量增加，细胞难以继续生长繁殖，需要进行分瓶培养，将培养的细胞分散，以1:2或l:3以上的比率转移到另外的容器中进行培养，即为传代培养，也叫做继代培养。传代的频率与接种细胞数量、细胞生物特性以及营养液的性质等有关。一般细胞可传代10-50代。所谓细胞“一代”，即从细胞接种到分离再培养的一段时间。它与细胞的世代或倍增不同。在细胞的一代中，细胞能倍增3~6次。培养细胞一代生长过程（一）潜伏期（Latentphase）：细胞从接种到贴壁生长繁殖的一段时间。（二）指数生长期：细胞增殖最旺盛时期，一般用细胞分裂指数（Mitoticindex，MI）表示，即细胞群中每1000个细胞中的分裂相数。体外培养细胞分裂指数介于0.1-0.5%，且受细胞种类培养液成分、pH、温度等影响。指数生长期是细胞活力最好的时期，可对细胞进行各种实验指数生长期持续3-5d后，随细胞数量不断增多，生长空间日趋减少，细胞相互接触汇合成片，呈现接触抑制。而恶性细胞则无接触抑制现象。癌细胞则由于营养成分的消耗和细胞代谢产物的影响而发生密度抑制（三）停滞期：即细胞数量达到饱和密度后，细胞与营养液的交换面积减少，代谢产物积累，pH下降细胞停止增殖，进入停滞期。在此时应及时进行传代，否则因细胞中毒受损，大量细胞出现死亡，至少再传1-2代后，细胞才能恢复。潜伏期指数增长期停滞期细胞的传代培养操作1、悬浮细胞可采用加入等量新鲜培养基后直接吹打分散进行传代，或用离心法后，加入新培养基后再吹打分散进行传代2、贴壁细胞（重点）贴壁细胞传代培养过程1、实验准备：细胞培养用的器材灭菌、超净工作台准备、试剂预温、操作人员准备。2、倒去瓶中的旧培养液，加入2～3ml的PBS缓冲液，轻轻振荡漂洗细胞，以除去悬浮在细胞表面的碎片和培养液。3、加入500ul胰蛋白酶消化液，37℃恒温箱消化30s，拍打瓶底，将贴壁的细胞拍落，可观察到液体变混浊（注意避免过消化）。刚加入合适过头4、向瓶中加入适量含有血清的培养液以终止胰酶的消化，反复吹打细胞，将附着在瓶壁的细胞吹打下来。5、将瓶中液体装入离心管中，1000r/min离心3min，弃去上清液。6、向管中加入1~3ml含有血清的培养液，反复吹打细胞，使其成为细胞悬液。7、以1：2或1：3进行分装，补充新鲜培养液，并在培养瓶上做好标记，注明代号、日期，轻轻摇匀，37℃恒温培养箱培养。8、观察：细胞培养24h后，即可观察培养液的颜色及细胞的生长情况。注意事项1．传代培养时要注意无菌操作并防止细胞之间的交叉污染。所有操作要尽量靠近酒精灯火焰。每次最好只进行一种细胞的操作。每一种细胞使用一套器材。培养用液应严格分开。2．传代时间的掌握：每天观察细胞形态，掌握好细胞是否健康的标准：健康细胞的形态饱满，折光性好，生长致密时即可传代。3、胰酶消化时间的掌握