高效液相色谱法原理及其应用

高效液相色谱法（HPLC）主讲人：周媛第一节高效液相色谱法基本原理色谱分析法是分析化学中获得广泛应用的一个重要分支，是一个具有强大生命力的分离分析技术。采用高压输液泵将规定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱，对供试品进行分离测定的色谱方法。注入的供试品由流动相带入色谱柱内，各组分在柱内被分离，并依次进入检测器，由积分仪或数据处理系统记录和处理色谱信号，最终得到各组分的色谱峰。（一）高效液相色谱法的特点一、与经典液相色谱法比较现代液相色谱法是在经典色谱理论的基础上，采用了高压泵、化学键合固定相高效分离柱、高灵敏专用检测器等新实验技术建立的一种液相色谱分析法。二、与气相色谱法比较1．分析对象的区别GC：适于能气化、热稳定性好、且沸点较低的样品；但对高沸点、挥发性差、热稳定性差、离子型及高聚物的样品，尤其对大多数生化样品不可检测占有机物的20%HPLC：适于溶解后能制成溶液的样品（包括有机介质溶液），不受样品挥发性和热稳定性的限制，对分子量大、难气化、热稳定性差的生化样品及高分子和离子型样品均可检测用途广泛，占有机物的80%2．流动相的区别GC：流动相为惰性气体，组分与流动相无亲合作用力，只与固定相有相互作用。HPLC：流动相为液体，流动相与组分间有亲合作用力，能提高柱的选择性、改善分离度，对分离起正向作用。且流动相种类较多，选择余地广，改变流动相极性和pH值也对分离起到调控作用，当选用不同比例的两种或两种以上液体作为流动相也可以增大分离选择性。3．操作条件区别GC：加温操作（※对气相色谱分离效率最有影响的因素）HPLC：室温；高压三、高效液相色谱法的特点1．分离效能高2．选择性高3．检测灵敏度高4．分析速度快（二）高效液相色谱法的分类及分离机制※按固定相的聚集状态分类：液液色谱法、液固色谱法按分离机制分类：分配色谱法、吸附色谱法、离子交换色谱法、空间排阻色谱法及亲合色谱法按流动相与固定相极性的相对强弱分类：正相色谱法、反相色谱法一、※液固吸附色谱法（LSC）流动相为液体，固定相为固体吸附剂分离机制：利用溶质分子占据固定相表面吸附活性中心能力的差异调节溶剂极性，可以控制组分的保留时间出柱顺序：强极性组分后出柱，弱极性组分先出柱二、※液液分配色谱法（LLC）分离机制：利用组分在两相中溶解度的差异※正相色谱—固定相极性流动相极性极性小的组分先出柱，极性大的组分后柱，适用于分离溶于有机溶剂的极性及中等极性的分子型物质，用于含有不同官能团物质的分离。※反相色谱——固定相极性流动相极性极性大的组分先出柱，极性小的组分后出柱用于分离非极性至中等极性的分子型化合物。通常对于亲水固定液采用疏水性流动相三、离子交换色谱法（IEC）※分离机制：利用组分与固定相表面离子的交换能力的差别（与流动相的性质无关）离子交换色谱与紫外－可见检测器适用于检测可离解化合物离子交换色谱与电导检测器结合适用于检测无机离子——离子色谱法（IC）四、空间排斥色谱法（SEC）分离机制：利用组分的分子尺寸与凝胶固定相孔径间的渗透系数的差别按流动相的性质不同：流动相为有机溶剂——凝胶渗透色谱流动相为水溶液——凝胶过滤色谱主要用于分离生物大分子组分五、亲合色谱法（AC）分离机制：利用组分与固定相表面上配基的专属性亲和作用的差别固定相——具有生物活性的配基键合到载体表面上形成适用于生物样品中酶、抗体、受体等的分离六、化学键合相色谱法（BPC）分离机制：利用化学反应将固定液的官能团键合在载体表面，使组分在吸附－分配的过程中分离应用较广泛的色谱法：反相键合相色谱固定相：极性小的烷基键合相C8柱，C18柱（ODS柱）流动相：极性大的甲醇-水或乙腈-水流动相极性固定相极性按分离过程物理化学原理分类的各种液相色谱法的比较吸附色谱分配色谱离子色谱空间排阻色谱亲和色谱固定相全多孔固体吸附剂固定液载带在固相基体上高效微粒离子交换剂具有不同孔径的多孔性凝胶多种不同性能的配位体键联在固相基体上流动相不同极性有机溶剂不同极性有机溶剂和水不同pH值的缓冲溶液有机溶剂或一定pH值的缓冲溶液不同pH值的缓冲溶液，可加入改性剂分离原理吸附与解吸溶解与挥发可逆性的离子交换多孔凝胶的渗透或过滤具有锁匙结构络合物的可逆性离解（四）高效液相色谱法的定性定量分析方法与气相色谱法的分析方法基本相同定性分析方法：色谱鉴定法化学鉴定法两谱联用鉴定法定量分析方法：外标法内标法面积归一化法（要求每一个组分都出峰）第二节高效液相色谱仪1．贮液瓶（滤芯，可滤去颗粒状物质）2．高压泵（输液泵、梯洗脱度）3．进样装置4．色谱柱——分离5．检测器——分析6．废液出口或组分收集器7．记录装置※（一）输液系统一、储液装置：过滤器二、脱气装置：脱气机流动相脱气：（1）吹氦脱气法（2）加热回流法（3）抽真空脱气法（4）超声波脱气法（5）在线真空脱气法流动相（淋洗剂、洗脱剂）是影响液相色谱分离的一个非常重要的实验因素。改变流动相的性质和组成将改变溶质组分的保留值、分离选择性和柱效。在实际工作中，流动相的可选择范围较大是液相色谱的一个显著特点。※液相色谱中,组分的保留值大小决定于组分与流动相和固定相分子间作用力：比如吸附、分配、离子交换、亲和力等。※（二）高压输液泵及梯度洗脱装置一、高压输液泵的种类高压输液泵可以分为以下两类：1．恒流泵：可输出恒定体积流量的流动相。（1）注射式泵（又称螺杆注射泵）（2）往复型泵（又称往复柱塞泵）往复柱塞泵，柱塞向前运动，液体输出，流向色谱柱；向后运动，将贮液瓶中液体吸入缸体。如此往复运动，保证将流动相以稳定的速度流过色谱柱的部件。二、高压输液泵的原理2．恒压泵：恒压泵又称气动放大泵，是输出恒定压力的泵。避免使用对不锈钢有腐蚀性的溶剂。例：硝酸、硫酸、盐酸、卤化物，四氯化碳与异丙醇或四氢呋喃的混合物等。过滤——用滤膜过滤或垂熔漏斗过滤脱气——采用超声或过滤的方法注意流动相使用前冲洗使用含酸、碱、缓冲液的流动相后，必须用不含盐的有机溶剂-水冲洗！二、高压输液泵的基本要求：1.流量范围宽2.重现性和准确度好3.输出的流动相无脉冲影响4.输出压力高且耐压5.密封性能好6.具备压力检测和保护功能三、高压输液泵的性能参数用于分析型输液泵的流量相对标准偏差在0.075%～0.3%流量范围是0.010～10ml/min流动相流速是1～3ml/min最高工作压力可达34.47～41.36MPa(300～500bar,5000～6000psi)四、梯度洗脱装置※梯度洗脱：又称为梯度淋洗或程序洗脱。在同一个分析周期中，按一定程度不断改变流动相的浓度配比，梯度性地改变洗脱液的组成。从而可以使一个复杂样品中的性质差异较大的组分能按各自适宜的容量因子k达到良好的分离目的。※梯度洗脱的原理：流动相由几种不同极性的溶剂组成，通过改变流动相中各溶剂组成的比例改变流动相的极性，使每个流出的组分都有合适的容量因子k，并使样品中的所有组分可在最短时间内实现最佳分离。※梯度洗脱的优点：1.缩短分析周期；2.提高分离能力；3.峰型得到改善，减少拖尾；4.增加灵敏度。但有时引起基线漂移。※（三）进样装置一、手动注射进样器二、六通阀进样装置三、自动进样器进样阀的基本要求：1.耐高压2.进样量准确3.进样重复性好4.无流量和压力波动影响进样阀的保护措施：1.在泵和进样阀之间安装在线过滤器，防止机械杂质进入进样阀。2.以缓冲液作流动相时，定期用水清洗进样阀，尤其是在色谱仪关机前。自动进样器的组成部分：1.进样阀2.样品环管3.进样针头4.样品瓶5.支架※（四）色谱柱色谱柱是液相色谱系统进行分离的核心部分，试样中各组分在色谱柱中被分离。色谱柱的要求：※柱效高：通过减小填料粒度来提高柱效※选择性好：可通过改变固定相的种类和流动相的种类来改变色谱柱的选择性。分析速度快一、柱材料及规格1．柱材料：色谱柱由柱管和固定相组成，柱管用不锈钢制成。HPLC柱的填料材料有硅胶、以硅胶为基质的键合相、氧化铝和有机聚合物微球等。2．※柱规格：粒度通常为3μm、5μm、7μm、10μm，柱长10～30cm，内径2～6mm，以4.6mm的内径最常用。目前以反相键合相色谱柱应用最多，尤其是C18、C8柱二、色谱柱的性能评价1.理论塔板数2.不对称因子3.保留值的重现性三、色谱柱的维护与保养1.加流路过滤器和保护预柱2.避免高压冲击3.采用适合柱的分离条件：PH、柱温和流动相4.过滤流动相和样品5.用强溶剂定期冲洗柱1.色谱柱的保养色谱柱使用与保存：所有色谱柱使用缓冲液后必须用柱体积20-30倍的水冲洗色谱柱色谱柱柱体积冲洗体积150×4.6mm2.5ml50ml200×4.6mm3.3ml65ml250×4.6mm4.2ml80ml（1）反相谱柱用后的保存：使用缓冲液或含盐溶液作为流动相，每天实验结束后，应用20倍柱体积的甲醇/乙腈－水溶液（5%）冲洗，使色谱柱内的盐完全溶解洗脱出，再用高浓度的甲醇/乙腈－水溶液（80%～100%）冲洗，使色谱柱中的强吸附物质冲洗出来。（2）※反相色谱柱长期保存：反相柱可以储存于甲醇或乙腈中，正相柱可以储存于经脱水处理的正己烷中，离子交换柱可以贮存于5%甲醇－水的溶液中，并将色谱柱两端的堵头拧紧，以免干枯，室温保存。3.色谱柱的维修（1）如果柱压实然增大，可将色谱柱出、入口端颠倒过来，用10～20倍柱体积的流动相冲洗。（2）如果峰形变坏，表明柱入口柱床可能有塌陷，可用同型号填料和乙醇配成匀浆，将塌陷处填平，压紧。2.色谱柱的再生（1）反相色谱柱的再生步骤：甲醇－二氯甲烷－正己烷－二氯甲烷－甲醇（2）正相色谱柱的再生步骤：无苯正己烷－二氯甲烷－异丙醇－二氯甲烷－无苯正己烷（3）离子交换柱的再生步骤：用稀酸缓冲液冲洗可使阳离子交换柱再生，用稀碱缓冲液冲洗可使阴离子柱再生。※（五）检测器一、定义检测器是将色谱洗脱液中组分的量转变成电信号的传感器，并由数据处理系统记录，根据所得色谱图上峰的位置、形状和大小，进行定性、定量分析。二、分类※通用型：示差折光检测器（DRID）、安培检测器（AD）、蒸发光散射检测器（ELSD）※专属型：紫外检测器（UVD）、可变紫外可见光检测器（DAD）、荧光检测器（FD）三、检测器的性能指标（1）噪声（2）基线漂移（3）灵敏度（4）线性范围（5）重复性四、紫外检测器1．固定波长紫外吸收检测器2．可变波长紫外吸收检测器3．光二极管阵列检测器只能检测有紫外吸收的物质，工作原理基于Lambert-Beer定律。五、可变波长紫外检测器是目前配置最多的检测器，可根据组分的最大吸收波长来设定检测波长。高效液相色谱仪的使用及维护使用HPLC级试剂和流动相清洁的仪器、流动相和样品，如果必要，进行过滤保证溶剂的相溶性如果必要，冲洗整个系统，去掉盐，防止污染在规定的pH范围内选用流动相对仪器的使用、维护和保养进行记录建立高效液相色谱分析方法的一般步骤通常在确定被分析的样品以后，要建立一种高效液相色谱分析方法必须解决以下问题：①根据被分析样品的特性选择适用于样品分析的一种高效液相色谱分析方法。②选择一根适用的色谱柱，确定柱的规格（柱内径及柱长）和所选用固定相（粒径及孔径）。③选择适当的或优化的分离操作条件，确定流动相的组成、流速及洗脱方式。④由获得的色谱图进行定性分析和定量分析。第三节高效液相色谱法应用示例盐酸左氧氟沙星滴眼液（5ml:15mg）含量测定测定方法：色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以醋酸铵高氯酸钠溶液（取醋酸铵4.0g和高氯酸钠7.0g，加水1300ml使溶解，用磷酸调节PH值至2.2）—乙腈（85:15）为流动相；检测波长为294nm。称取左氧氟沙星对照品、环丙沙星对照品和杂质E对照品各适量，加0.1mol/L盐酸溶液溶解并稀释制成每1ml中约