高效液相色谱法教学课件【全】

高效液相色谱法HighPerformanceLiquidChromatography（HPLC）前言:HPLC是70年代以后发展最快的一个分析化学分支，现已成为生化、医学、药物、化学化工、食品卫生、环保检测等领域最常用的分离分析手段。我国：开始仅为少数研究实验室拥有，现很多的生产、研究、质检部门都拥有。广泛应用于：质量控制、分析化验、制备分离。讲课目的：入门教材：《实用色谱法》（詹益兴编著）学习要求：记好笔记，以课堂教学内容为主。课时安排：第一章：高效液相色谱的基本原理4学时第二章：高效液相色谱的仪器装置2学时第三章：液固、键合相色谱3学时第四章：离子交换色谱和离子对色谱3学时第五章：凝胶渗透色谱1学时第六章：实验技术和辅助实验技术1学时复习1学时参考书籍：1.色谱理论基础（卢佩章、戴朝政编）2.高效液相色谱法（邹汉法、张玉奎、卢佩章编著）3.高效液相色谱方法及应用（色谱技术丛书、化学工业出版社、于世林编著)§1－1概述一、色谱法混合物最有效的分离、分析方法。是一种分离技术。混合物分离过程：试样中各组分在固液两相间不断进行着的分配。一相固定不动，称为固定相。另一相是携带试样混合物流过固定相的液体，称为流动相。第一章高效液相色谱法基本原理液相色谱仪高效液相色谱仪流程图二、色谱法原理–混合物中各组份在不互溶的两相中溶解、吸附等化学性能存在差异；–当两相相对运动时,各组分在两相中反复多次进行平衡分配而达到相互分离。分离原理:分离是一个物理过程。固定相(StationaryPhase)流动相(MobilePhase)进样(Injection)洗脱(Elution)相互作用(Interaction)三、高效液相色谱法的特点高压:以液体作为流动相，液体流经色谱柱时，受到阻力较大必须对流动相施加高压。一般可达到150～300kg／cm2，甚至可达700kg／cm2以上。高速:分析时间较经典液相色谱少得多（交换速度快），一个复杂样品的分析仅需几分钟到几十分钟。高效:气相色谱的分离效能很高，高效液相色谱的柱效则更高（化学键合相），一般约可达6000理论塔板／米高灵敏度①紫外检测器的最小检测量可达(10-9g)；荧光检测器的灵敏度可达（10-11g）。②所需试样很少；微升数量级高选择性可分离不同类型化合物和异构体，也可分析在性质上极为相似的化合物(同位素、同分异构体、空间异构体、手性化合物）高效液相色谱法的特性:高压、高效、高速、高灵敏。适用：高沸点、热不稳定样品四、HPLC与GC区别1．分析对象的区别GC：适于能气化、热稳定性好、沸点低的样品，占有机物的20%HPLC：适于溶解后能制成溶液的样品.对分子量大、难气化、热稳定性差样品均可检测。占有机物的80%2．流动相的区别GC：流动相为惰性，组分与流动相无相互作用力，只与固定相有相互作用。HPLC：流动相为液体，流动相与组分间有相互作用力，参与和影响色谱分离.对分离起主要作用。3．操作条件差别GC：加温操作HPLC：室温；高压说明：气相、液相地位同样重要两种互补不足的色谱方法灵敏度：气相﹥液相应用范围：液相﹥气相五、色谱法的分类吸附色谱(AbsorptionChromatography)组分对固定相表面吸附力的不同而分离分配色谱(PartitionChromatography)组分在固定相和流动相中的溶解度不同而分离离子交换色谱(IonExchangeChromatography)组份离子交换亲和力的差异而分离体积排除色谱(SizeExclusionChromatography)组分分子量大小不同,对固定相的渗透力不同而分离§１－２基本概念一、色谱图记录仪所记录的浓度对分离时间的函数，称为色谱图。色谱过程特点：①浓度对分离时间呈高斯曲线型②色谱条件一定时，各组分都有一特定时间在图谱中出现，称为组分的保留时间。③柱效一定时，组分保留值越小，峰越窄；保留值越大，峰越宽。④相邻峰的保留时间相差越大，越易分离。二、色谱参数1.保留时间-tR从进样开始到柱后出现样品的浓度极大值所需的时间，用tR表示。2.分配系数K在一定温度下，组分在两相间分配达到平衡时的浓度比（单位：g/mL），称为分配系数KMSccK组分在流动相中的浓度组分在固定相中的浓度分配系数是色谱分离的依据。K值小，先流出柱子；K值大，保留作用强，后流出柱子。分配系数K的讨论一定温度下，组分分配系数K越大，出峰越慢；每个组份在各种固定相上的分配系数K不同；选择适宜的固定相可改善分离效果；各组分有不同K值是分离的基础（差移速度）某组分的K=0时，即不被固定相保留，最先流出。组分在流动相中的浓度组分在固定相中的浓度K3.容量因子k’(capacityfactor)一定温度下，组分在两相间分配达到平衡时的质量比。MSmmk组分在流动相中的质量组分在固定相中的质量’1.Ｋ与k’都是与组分及固定相的热力学性质有关的常数,随分离柱温度、柱压的改变而变化2.容量因子可以由实验测得。3.色谱的保留作用：组分理化性质不同→两相间分配量不同→柱内保留时间不同4.容量因子与保留时间的关系0oR'tttkk’太小---没有充分利用填料的分离能力k’太大---分析时间太长k’范围：１～１０k’∝1/ε0（ε0溶剂强度——使组分迁移快慢的能力）P310表3-10tR=to(1+k’)5.选择性系数α可用来衡量两物质的分离程度，用α表示。1'R2'R1212''αttkkKK色谱理论需要解决的问题？色谱分离过程的热力学和动力学问题。组分保留时间为何不同？色谱峰为何变宽？组分保留时间：色谱过程的热力学因素控制；（组分和固定相的结构和性质）色谱峰变宽：色谱过程的动力学因素控制；（两相中的运动阻力，扩散）两种色谱理论：塔板理论和速率理论。§1-3色谱柱的分离效率一、塔板理论塔板理论认为:一根柱子可以分为n段，每段内组分在两相间迅速达到平衡，把每一段称为一块理论塔板。设柱长为L，理论塔板高度为H，则H=L/ＮＮ为理论塔板数。理论塔板数一N①色谱峰对称：说明：a.在给定的操作条件下，N几乎相同b.N为常量时，tw随tR成正比例变化c.与柱长有关:比较不同长度色谱柱的柱效时，应当比较它们在相同柱长下的N值。例d.是一种理想状态2WR)tt16(N②有拖尾峰时:可用半峰宽来表示N：N＝5．54(tR/W1/2)2W1/2-----半峰宽例：测得tR=105mm、W1/2=4mm，求得N=3789，若此柱长为250mm,折成每米的理论塔板数约为15200.理论塔板高度HNLH2Rw)tt(16LH2WR)tt16(N物理意义：组分在两相间达到一次平衡对应的柱长H愈小→组分在两相间平衡分配次数越多→柱效↑（不能说明分离一定实现）说明：①Ｎ大，固定相分离潜能大。（分离与否，还取决于其他色谱条件）②一定色谱条件下，对k’有差异的组分，则柱效愈高，分离效果愈好。塔板理论的特点和不足：(1)当L一定时，N越大(H越小)，被测组分在柱内被分配的次数越多，柱效越高，所得色谱峰越窄。(2)柱效不能表示被分离组分的实际分离效果：如两组分的分配系数K相同，无论该色谱柱的柱效多大，都无法分离。(3)塔板理论无法解释同一色谱柱在不同的流动相流速下柱效不同的实验结果，也无法指出影响柱效的因素及提高柱效的途径。二.峰扩展和速率方程式1.峰扩展--由于柱内柱外各种因素引起的色谱峰变宽或变形，从而造成色谱柱效的降低峰扩展程度：取决于组分在柱内的平衡分配次数例：引起峰扩展因素：柱内、柱外2.速率方程式（范·弟姆特方程式）H=A+B/u+C·uH：理论塔板高度，u：流动相流速(cm/s)。减小A、B、C三项可提高柱效。A，B，C三项各与哪些因素有关？A─涡流扩散项A=2λdpdp：固定相的平均颗粒直径λ：固定相的填充不均匀因子固定相颗粒越小dp↓，填充得越均匀，A↓，H↓，柱效Ｎ↑。表现在涡流扩散所引起的色谱峰变宽现象减轻，色谱峰较窄。B/u—分子扩散项B=2υDD：试样组分分子的扩散系数（cm2·s-1）(1)存在着浓度差，产生纵向扩散;(2)扩散导致色谱峰变宽，H↑(Ｎ↓)，分离变差;(3)B/u与流速有关：流速↓→滞留时间↑→扩散↑(＞0.5ml/min)(4)扩散系数D，Ｄ↓→B值↓。液相中，分子扩散可忽略C·u—传质项传质—溶质分子在两相间浓度不同，由浓度高的相不断迁移至浓度低的相，直到浓度达到平衡。根据传质形式分：固定相传质移动相传质C=（Cs+Cm）固定相传质原因：进出固定相速度不同（固相，液相）减小措施：①使用薄的固定相层②小颗粒填料移动相传质原因：迁移滞留减小措施①填装均匀紧密②使用小颗粒填料和表面多孔性填料3.速率理论的要点:(1)柱内的峰扩展与涡流扩散、分子扩散、传质阻力有关。(2)通过选择适当的固定相粒度、液膜厚度及流动相流速可提高柱效。(3)为色谱分离和操作条件选择提供了理论指导。阐明了流速和填料对柱效及分离的影响。选择最佳条件，才能使柱效达到最高。4.获得高柱效的几种方法：①选用细的颗粒填料②流动相流速低③流动相粘度小④升高温度⑤溶质扩散系数与其结构有关ⅰ大分子，扩散系数小ⅱ小分子，扩散系数大5.影响分离的因素与提高柱效的途径•液体的扩散系数仅为气体的万分之一，在高效液相色谱中,速率方程中的分子扩散项B/u较小，可忽略不计，即H=A+Cu•降低传质阻力是提高柱效主要途径。•气相和液相Ｈ－ｕ区别§１－４分离度(Rs)色谱分离目的：----------合理的时间内将样品中组分成功分离分离度：表示分离状况的一种度量分离度影响因素：保留值之差──色谱过程的热力学因素；峰的宽度──色谱过程的动力学因素。讨论：色谱分离中的四种情况：①柱效较高，ΔK(分配系数)较大，完全分离。②ΔK不是很大，柱效较高，峰较窄，基本分离。③柱效较低，ΔK较大，但分离的不好。④ΔK小，柱效低，分离效果更差。一．分离度的数学表达式：Rｓ=0.8：两峰的分离程度可达89%；Rｓ=1：分离程度98%(达到定性定量分析的最低要求)Rｓ=1.5：达99.7%（相邻两峰达到基线分离）。][699.1)(2)(2)1(2/1)2(2/11R2R121R2RYYttWWttRs对浓度不同组分而言：两个组分的分离度会随浓度比的增大而减小例：对多组分而言：整个色谱分离的分离度取决于Rs最小值的两个峰。二．分离度影响因素①峰的宽度（峰宽越小，Rs越大）峰的宽窄主要反映了色谱分离的动力学特性②两峰的保留时间之差（△tR越大，Rs越大）反映了色谱分离的热力学特性分离度基本关系式：1k'k'α1αN41Rs121R2R)(2WWttRs四．控制分离度方法①改变k’调节溶剂强度可以改变k’增大ｋ’---使用较弱溶剂降低ｋ’---使用较强溶剂正相色谱---固定相极性大于移动相（溶剂极性大→溶剂强度大→洗脱能力强→ｋ’小）反相色谱---固定相极性小于移动相（溶剂极性大→溶剂强度小→洗脱能力弱→ｋ’大）P307~311例:流动相极性变化对组分k’的影响②更换色谱柱（改变N）措施：a.选择长柱子(N=L/H)b.填料颗粒尽量小c.低流速(溶质传质阻力小，峰扩展小)d.低的溶剂粘度(提高柱效)e.提高柱温③改变选择性系数1'R2'R1212''αttkkKK（α=1，不能实现分离)下列途径改善：a.流动相梯度洗脱—洗脱过程中，流动相组成随时间的变化而变化P279（适用于极性范围宽的样品）b.固定相(换柱，改变填料）c.温度（改变热力学参数）五.分离度控制的一般原则:①开始k’值很小，若要增大Rs，则首先应将k’调整至1＜k’＜10范围，这样，不用改变其他条件，就可使Rs增大。②开始k’已在1＜k’＜10范围，但Rs不大，则必须增大N来改善Rs。③k’，N的改变都不能增大Rs时，再设法改变α第二章仪器装置四大部件：高压输液泵进样器高效分离柱检测器§2－1高压输液泵作用：向色谱柱输送一个连续、恒定的移动相。一、对泵系统的要求1.使用方便（易调