TUNEL法检测细胞凋亡

细胞在发生凋亡时，会激活一些DNA内切酶，这些内切酶会切断核小体间的基因组DNA。基因组DNA断裂时，暴露的3’-OH可以在末端脱氧核苷酸转移酶(TerminalDeoxynucleotidylTransferase,TdT)的催化下加上荧光素(FITC)标记的dUTP(fluorescein-dUTP)，从而可以通过荧光显微镜或流式细胞仪进行检测，这就是TUNEL法检测细胞凋亡的原理。TUNEL法特异性检测细胞凋亡时产生的DNA断裂，但不会检测出射线等诱导的DNA断裂(和细胞凋亡时的断裂方式不同)。这样一方面可以把凋亡和坏死区分开，另一方面也不会把射线等诱导发生DNA断裂的非凋亡细胞判断为凋亡细胞。针对问题2（TUNEL法的实验原理是什么？）：基本原理：对不同组织切片先增加细胞膜通透性，然后让rTDT和bio标记的dUTP进入细胞内，在rTDT的辅助下dUTP与核断裂的DNA3’-OH结合，再用HRP标记的链霉亲和素与dUTP上的biotin结合（每个链霉亲和素至少可以再结合3个biotin分子），最后用DAB、过氧化氢与SP上的辣根过氧化物酶HRP发生氧化、环化反应，形成苯乙肼聚合物而呈现棕褐色，最终通过计数每张切片上不同视野中TUNEL阳性细胞的比例来判断细胞凋亡发生情况。1.TUNEL工作原理：简单说就是——TUNEL细胞凋亡检测试剂盒是用来检测细胞在凋亡过程中细胞核DNA的断裂情况。其原理是；生物素（biotin）标记的dUTP在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdTEnzyme）的作用下,可以连接到凋亡细胞中断裂的DNA的3'－OH末端，并可与连接了的辣根过氧化酶的链霉亲和素（Streptavidin-HRP）特异结合，在辣根过氧化酶底物二氨基联苯胺（DAB）的存在下，产生很强的颜色反应（呈深棕色），特异准确地定位正在凋亡的细胞，因而在普通显微镜下即可观察和计数凋亡细胞；由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂，因而没有3'-OH形成，很少能够被染色。针对问题3（TUNEL实验中几个关键步骤是什么？）：1.充分脱蜡和水化。脱蜡可以先60度20min，再用二甲苯两次5~10min；而水化用梯度乙醇从高浓度到低浓度浸洗，这些以便后面的结合反应充分、均匀；2.把握好细胞通透的时间。一般根据切片的厚薄，选择蛋白酶k的孵育时间，常用10~30min，几um切片用短时间；几十um切片用长时间，通过摸索达到既不脱片，有能够使后面的酶和抗体进入胞内。3.适当延长TUNEL反应液的时间。一般是37度1h，你也可以根据你的凋亡损伤程度，选择更长的时间，可长至2h，但要结合你最终的背景着色。4.DAB显色条件的选择。一般DAB反应10分钟左右，结合镜下控制背景颜色，最长不超过30min；我不喜欢用promega公司提供的DAB液（桃红色），不利于辨认棕褐色。5.PBS的充分清洗。我个人认为，在TUNEL反应后和酶标反应后的清洗应十分严格，可增加次数达5次，因为这些清洗直接决定最后切片的非特异性着色。6.此外，内源性POD的封闭也十分关键。对于肝脏、肾脏等血细胞含量多的组织，我的经验是适当延长封闭时间和升高过氧化氢的浓度，可以达到很好的封闭效果，且不影响最终的特异性染色。针对问题5.细胞通透的原理、通透剂的浓度、孵育时间及其配制方法？1.蛋白酶K是消化膜蛋白，从而起打孔作用，增加膜通透性，使rTDT酶、抗体易透过细胞膜进入细胞反应；2.蛋白酶K一般工作液浓度为20ug/ml,但浓缩液可配制1~10mg/ml，可用PBS配制，也可用蛋白酶K缓冲液（100mMTrisHClPH8.0+50mMEDTA）；3.蛋白酶K反应时间一般为10~30min，具体时间长短与切片厚薄有关，4um左右的片子可以用10min，但30um左右的可用30min，最终通过摸索最佳时间。过长易脱片、过短起不到通透效果。1.抗原修复的原因是标本在甲醛等固定过程中，因发生蛋白交联和甲醛的封闭作用使抗原性降低，可以通过抗原修复使抗原决定族充分暴露出来；2.免疫组化中经常使用抗原修复，因为它的原理主要是抗原和抗体反应，通过抗原修复使更多的抗原与抗体结合，避免假阴性结果；3.而TUNEL的原理是dUTP与断裂的DNA上的3‘OH结合，故不需抗原修复；4.第一次TUNEL反应只需37度反应1h，或者延长时间即可1.PROMEGA公司去年是40t要3300元（按100ul/片，实际可根据切片大小，加到30ul/pian）；而roche公司一般10t国内分装1300元（同样也是100/pian）；2.两个公司试剂盒内均没有PBS试剂，也不含DNase（以制作标准对照片）；3.我一般用4%PFA多聚甲醛，至少浸泡24h后进行石蜡包埋、制片。此外，Promega公司在操作步骤中加了两步4%PFA以固定组织，试剂盒内无PFA，但提供了配制方法。再次请教：1.我做TUNEL复染用苏木素几秒钟，请问还用不用1％盐酸究酒精分化了？2.我想用罗氏的TUNEL试剂盒做荧光显像，请问用什么封片，配方？针对你的问题，我分析如下：1.盐酸酒精分化的目的：一方面是分色；另一方面是减弱过强的苏木素核染色。所以你若把握好苏木素着色，也可不分化。2.分化时间不能过长，否则阳性着色也褪色。3.一般荧光成像后可用高纯度甘油封片即可，若需长期保存，也可用无色指甲油片周围封固（必要性不大）。这是我的操作步骤（Promega公司），看完后就知道了：1.脱蜡：用二甲苯浸洗5min×2次；2.水化：用梯度乙醇（100％×5min、100％×3min、95％×3min、85％×3min、70％×3min、50％×3min）；3.浸洗：0.85％NaCl×5min→PBS洗5min；4.固定：浸入4％多聚甲醛15min；5.浸洗：PBS5min×2次；6.细胞通透：用每片100ul20μg/mlProteinaseK处理组织15（10~30）minRT；7.浸洗：PBS洗5min；8.固定:浸入4％多聚甲醛5min；9.浸洗：PBS5min×2次；10.平衡：加100ul平衡液，湿盒平衡10（5～10）min；11.制备TUNEL反应混合液：处理组用1μlrTdT＋1μl生物素标记的dUTP＋98ul平衡液混匀；而阴性对照组不加rTdT，改为三蒸水；阳性对照组先加入100μlDNase1缓冲液孵育5min，甩掉液体后再加100ulDNase1（10U/ml）酶切10min，用去离子水冲洗4次，PBS浸洗5min，后面步骤从第10步开始。12.标记反应：加100μlTUNEL反应混合液于标本上，加盖玻片或封口膜在暗湿盒中反应37℃×1h。13.终止反应：浸入2×SSC15min；14.浸洗：PBS5min×3次；15.封闭POD：浸入0.3％H2O215min；16.浸洗：PBS5min×3次；17.酶标反应：加100ulstreptavidin标记HRP（按1:500PBS稀释）30min；18.浸洗：PBS5min×3次；19.DAB显色（避光）：加100ulDAB混合液（50ulDAB+50ulDAB底物缓冲液＋50ulH2O220×＋950ul三蒸水）10min左右，镜下出现浅棕色背景时。20.用去离子水冲洗几次；21.用苏木素复染，3s左右后立即用自来水冲洗。梯度酒精脱水（50、70、85、95、100、100％各1min）、二甲苯透明1min×2次、中性树胶封片。1、蛋白酶k的目的是通透细胞膜和核膜，从而使反应试剂充分进入细胞核进行反应，提高阳性率。但浓度过高或孵育时间太长容易脱片，只要不脱片，好像影响不大，其作用类似与TritonX100等细胞通透剂。2、蛋白酶K浓度配成贮存液浓度1mg/ml是可以的，好像工作液浓度是20ug/ml吧，然后分装成小份，用完一支再用下一支，-20度保存1个月应该没问题的（重复拿的那支），而一直冷冻的至少半年以上（我试过的）。