聚合酶链式反应-2014

第三章聚合酶链式反应（polymerasechainreaction,PCR）聚合酶链反应•又称体外DNA扩增技术。是利用耐热DNA聚合酶的反复作用，通过变性-退火-延伸循环操作，在体外特异地扩增所需要的DNA片段的一种技术。它能快速将皮克(pg)水平的DNA特异地扩增100万倍左右，达到微克(g)水平。•优点：敏感度高、特异性强、产率高、重复性好以及快速简便等。在分子生物学、基因工程研究，以及遗传病、传染病和恶性肿瘤等基因诊断和研究中得到广泛应用。并已普及到许多普通实验室，大大简化了传统的分子克隆技术，便于对目的基因进行分析、鉴定。目的基因载体复制子宿主细胞扩增扩增提取DNA分子通常的DNA扩增法是分子克隆法,首先要构建含有目的的基因的载体,然后将它导入细胞后进行扩增,还要用同位素探针等方法进行筛选；经过DNA内切、连接、转化和培养等相关的过程，操作复杂,一般需要数周时间。•70年代的初期由Dr.H.Klenow发现了较具有实验价值及实用性的KlenowfragmentofE.Coli；•1976年从温泉中的细菌（Thermusaquaticus）分离出来的Taqpolymerase，它的特性能耐高温。80年代之后它被广泛运用；•1983年美国Mullis等人发明了聚合酶链反应方法；•1985年美国PE-Cetus公司开发出了具有应用价值的PCR技术；•1987年引入了耐高温的DNA聚合酶，从而使PCR成为一项成熟的技术，而迅速在世界各地推广。•1993年Mullis也因此获得了诺贝尔化学奖。PCR技术的发现KaryBMullis(1944-)1983年提出PCR方法1993年度诺贝尔化学奖一、PCR基本原理•PCR是一项DNA体外合成技术，类似于生物体内的DNA复制过程。•依据DNA半保留复制的机理。•PCR合成DNA比细胞内复制过程简单。第一节PCR技术的原理和特点细胞内复制的过程1）细胞内有关蛋白质参与下，DNA双螺旋解链成两条单链，各自作为模板。2）引物酶以两条单链为模板各自合成一段引物，引物提供3’-OH末端。3）DNA聚合酶以亲代DNA单链为模板，以dNTP为原料，按照碱基配对的原则，从引物的3’端，循5’→3’方向，将脱氧核苷酸聚合，最终形成子代的DNA双链。Denaturing95˚CAnnealingTm-5˚CExtension72˚CPCR的原理PCR的基本过程1.变性：将反应体系升温至95℃左右，样品中双链DNA解开成两条单链，各自作为模板（待拷贝的DNA称为模板）。2.退火：将温度降至引物的Tm值以下(55℃左右)，5’端和3’端的引物各自与两条单链DNA模板的互补区域结合。5’5’3’3’模板链3’端引物5’端引物3’3’3.延伸：将温度升到75℃左右，耐热的TaqDNA聚合酶催化四种dNTP，从引物3’-OH端开始，依据模板碱基序列互补方式依次聚合，合成一条互补的DNA链。5’5’3’3’5’DNA聚合酶5’Cycle3555555555555555525～30次循环后，模板DNA的含量可以扩大100万倍以上。PCR的扩增效应•理论上，每增加1个循环，双链DNA片段会增加1倍，使DNA量可成指数(2n)增加。•实际上，扩增效应低于指数增加，约为(1+X)n。•一般进行30个左右的循环，特定区域的DNA量可至少增加106倍。PCR产物的积累规律•PCR反应初期，目的DNA片段的增加呈指数扩增。随着目的DNA扩增产物的逐渐积累，酶的催化反应趋于饱和，此时DNA扩增产物的增幅减慢，即出现“平台效应”。•到达平台期所需要的循环次数一般在30次循环之后。琼脂糖凝胶电泳PCR产物的鉴定、提取PCRDNA复制部位：DNA体外合成放大过程生物体内DNA合成引物：DNA片段RNA片段（作为新链的一部分）（复制终止时被切除）催化酶：TaqDNA聚合酶DNA聚合酶有5’→3’核酸外切酶有5’→3’核酸外切酶无3’→5’核酸外切酶有3’→5’核酸外切酶基本过程：每循环一次包括复制起始、链延伸和变性、退火、延伸终止三阶段反应实质：扩增靶DNA合成子代DNAPCR仪聚合酶链反应中的变性、退火、延伸的温度和时间，以及循环次数，是由具有程控的快速升温和快速降温装置的PCR仪控制。PCR仪越快，越精确，越昂贵ABI7500实时荧光定量PCR仪•普通梯度PCR仪二、PCR技术的特点1.高度的敏感性：可将极微量(pg)DNA，扩增到紫外光可见的水平(ug)，这是最主要的特点，PCR产物的生成量以指数方式增加，它可对单拷贝基因、单个细胞、单根头发、一滴血等微量标本进行分析。2.高度的特异性：PCR扩增的特异性由两个引物的序列决定，因此引物设计至关重要。•①引物与模板DNA特异正确的结合；②遵循碱基配对原则；③TaqDNA聚合酶合成反应的忠实性；④选择特异性与保守性高的靶基因。引物引物引物的序列及其与模板结合的特异性是决定PCR反应结果的关键。引物设计的原则是最大限度地提高扩增效率和特异性；同时尽可能减少非特异性扩增。基因组3.适用样品的广泛性：对样品的要求并不十分严格：1)可以是DNA，也可以是RNA2)可以是纯化的，也可以是粗制的3)可以是新鲜组织，也可以是陈旧组织4)可以是细胞，也可以是体液4.操作简便、快速：PCR自动化，数小时完成。扩增产物一般用电泳分析，不一定要用同位素，无放射性污染、易推广。三、参与PCR反应体系的因素及其作用•模板•引物•TaqDNA聚合酶•dNTP•Mg2+•缓冲液•反应温度•循环次数•PCR仪等PCR体系（一）模板—核酸1.模板：指能扩增靶DNA片段的核酸2.DNA是直接模板，RNA是间接模板RNA样品必须先经过逆转录生成cDNA，cDNA作为PCR扩增的模板。这个技术称为逆转录PCR（RT-PCR）。•病原体标本：有病毒、细菌、真菌、螺旋体、立克次体、支原体等。•病理生理标本：有细胞、血液、绒毛、羊水细胞、尿液、上皮细胞、体外培养细胞系。•法医学标本：有血斑、精斑、毛发等。•考古标本：残留有核酸物质3.常见的扩增对象(含核酸的标本)：4.避免有影响扩增反应的物质存在如：核酸酶：降解DNA、RAN蛋白酶：降解TaqDNA聚合酶血红素、抗凝剂：抑制TaqDNA聚合酶活性理论上，要获得最好的特异性及忠实性的扩增只向反应体系中加入单一拷贝的靶序列DNA作为模板。人基因组DNA0.1-1μg大肠杆菌基因组DNA10-100ngλDNA0.5-5ng质粒DNA0.1-10ng5.模板量要合适，一般为102~105拷贝。50μlPCR反应体系中模板DNA推荐使用量（二）引物1）引物：2条人工合成的、能与模板DNA互补结合的脱氧寡核苷酸。1.引物的性质和作用2）引物的序列：根据欲扩增的DNA片段两端序列而设计的。5’端引物：与模板链的5’端序列相同；3’端引物：与模板链的3’端序列互补。5’5’3’3’模板链3’端引物5’端引物3’3’3)引物决定PCR扩增产物的特异性和长度。4)引物设计决定PCR反应的成败。特异性：引物只针对DNA的一个特定序列互补结合，因此2条引物与DNA模板特异性结合决定了要扩增的DNA区域。长度：2条引物分别互补于所要扩增DNA片段的两端，使DNA片段的扩增只限于引物之间的部位。2.引物设计的基本要求1）引物长度要合适，一般为16～30个核苷酸，常用20bp左右。•引物过短：会影响PCR的特异性；•引物过长：需提高相应的退火温度2）G+C含量一般占40％～60％，有利于引物与模板的结合。GC太少扩增效果不佳，GC过多易出现非特异条带。3）ATCG4种碱基随机分布，避免连续出现3个以上相同的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列，最好随机分布。否则易使引物与模板的嘌呤或嘧啶密集区发生错配。4）引物内部不能存在互补序列，以避免形成发夹结构。5）两个引物之间不能存在互补序列，以避免形成引物二聚体。6）引物与非特异性序列的同源性不能超过70%或不能连续8个碱基互补，否则导致非特异性扩增。7）引物3’末端碱基一定要与模板正确配对，引物3’端最佳碱基选择是G和C。8）引物的5’端可以修饰，如：引入酶切位点、启动子序列、用荧光素、生物素等标记等9）引物扩增跨度：以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。5’限制性内切酶的识别序列启动子序列定点突变探针标记引物3’端为关键碱基；5’端无严格限制。3’3’5’GC3.引物的使用要求•引物浓度要远高于模板浓度，以最低引物量产生所需要的结果为好。引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。•合适的退火温度比引物本身的Tm低5℃，一般在55℃左右。（三）TaqDNA聚合酶TaqDNA聚合酶是从一种水生栖嗜热菌YT1株(嗜热真菌)分离提取出来，该酶基因全长2.49kb，编码832个氨基酸。该酶虽然在90℃以上几乎无DNA合成，但确有良好的热稳定性。（天然酶）另一类通过基因工程合成的酶。（基因工程酶）TaqDNA聚合酶的热稳定性是该酶用于PCR反应的前提条件，也是PCR反应能迅速发展和广泛应用的原因。(一)酶活性与热稳定性1）酶蛋白分子量94KDa，比活性200000∪/mg，Taq酶的浓度通常为1~2.5∪/l，太多浪费并易导致非特异性扩增。2）热稳定性好：能耐受DNA变性时的高温在92.5℃、95℃、97.5℃时，PCR混合物中的TaqDNA聚合酶分别经130min、40min、5min后，仍可保持50%的活性。PCR反应时变性温度为95℃～20sec，50个循环后，TaqDNA聚合酶仍有65%的活性。1）TaqDNA聚合酶是Mg2+依赖性酶，对Mg2+浓度非常敏感。2）Mg2+浓度2.0mmol/L时，能最大限度地激活TaqDNA聚合酶的活性。3）Mg2+能与dNTP结合而降低PCR反应液中游离的Mg2+浓度，优化浓度一般反应中Mg2+浓度至少应比dNTP总浓度高0.5～1.0mmol/L。4）适当浓度的KCl能使TaqDNA聚合酶的催化活性提高50～60%。(二)离子依赖性1）TaqDNA聚合酶具有5′→3′聚合酶活性和5′→3ˊ外切酶活性，而无3′→5′外切活性，在PCR反应中如发生某些碱基的错配，该酶是没有校正功能。TaqDNA聚合酶的碱基错配机率为2.1×10-4。2）TaqDNA聚合酶还具有逆转录酶活性.(三)忠实性(四)Taq酶的最适温度75~80℃可延伸约150个脱氧核苷酸/秒/酶分子，70℃延伸率大于60个脱氧核苷酸/秒/酶分子，55℃时为22个脱氧核苷酸/秒/酶分子。最适温度75℃左右。（四）原料•原料：四种脱氧核苷三磷酸(dNTP)：浓度为20~200µmol/L。•Mg2+：为Taq酶的必需激活剂。浓度为0.5~2.5mmol/L。太少：酶活性明显降低；太多：导致非特异性扩增。（五）Mg2+反应温度和时间1.变性：95℃，30”~1’双链DNA变成单链。2.退火：55℃，30”~1’引物与模板互补结合。退火温度对特异性影响很大。退火温度=Tm值-(5～10℃)Tm值=4(G+C)＋2(A+T）Tm值=62.3℃＋0.41℃(G-C%)3.延伸：72~75℃，1’~2’Taq酶催化dNTP，从引物3’-OH端开始，与模板互补，合成一条新的DNA链。小于20bp片段大于20bp片段•反应缓冲液：常用10mmol/LTris-HCl缓冲液，pH8.3~8.8为Taq酶最适pH值。•循环次数：主要取决于模板DNA的起始浓度，合适的循环数为25~30次。循环数太少：产物量不多循环数太多：非特异性扩增会增加，出现平台效应PCR反应体系5×扩增缓冲液10ul4种dNTP混合物各200umol/L引物各10～100pmol模板DNA0.1～2ugTaqDNA聚合酶2.5uMg2+1.5mmol/L加双蒸水至50ul四、PCR常见问题1.无扩增产物1.模板:含有抑制物，含量低2.Buffer对样品不合适3.引物设计不当或者发生降解4.反应条件：退火温度太低延伸时间